甘露消毒丹中芳香藥物防治流感的作用機制探討
——基于網(wǎng)絡藥理學

侯宏彬，劉光華，吳振起，任園園，湯玉梅，鐘潤鋒

(1.遼寧中醫(yī)藥大學 研究生院，遼寧 沈陽 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學 中醫(yī)學院，遼寧 沈陽 110847；3.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 兒科，遼寧 沈陽 110032)

流感即流行性感冒是流感病毒引起的一種常見的呼吸道傳染性疾病。近年來爆發(fā)流行的H5N1禽流感病毒、H9N2禽流感病毒、甲型H1N1禽流感病毒都表現(xiàn)出發(fā)病時間短、傳變速度快、易造成廣泛流行的特點，流感病毒易突變的特性也使疫苗與相關藥物的研制滯后，因而其流行變得更加頻繁，嚴重威脅人們的健康。

甘露消毒丹是中醫(yī)學中運用芳香藥物治療流感的代表方劑，首見于葉天士的《醫(yī)效秘傳》，甘露消毒丹中的芳香藥物有石菖蒲、廣藿香、薄荷、蔻仁、茵陳，具有芳香辟穢、開竅化濁、宣肺通絡、醒脾和胃之效。

1 資料與方法

1.1 獲取芳香中藥的化學成分

通過Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP)網(wǎng)站查詢獲得上述芳香藥物的化學成分。

1.2 篩選藥物的有效成分

根據(jù)口服生物利用度(OB)≥30%，藥物相似性(DL)≥0.18的標準篩選藥物的有效成分[1]。

1.3 獲取上述芳香藥物的有效成分及靶點信息與流感的靶點并預測潛在的作用靶點

采用TCMSP平臺獲取上述芳香藥物的有效成分及靶點信息并加以分析整理。在GeneCard數(shù)據(jù)庫中輸入“influenza”并檢索，獲得與流感相關的靶點，并根據(jù)相關性得分篩選，保留得分大于1.5的流感潛在的作用靶點[2]。在Draw Venn Diagram網(wǎng)站將上述芳香藥物的有效成分靶點與流感潛在的作用靶點在線繪制成Venn圖，通過繪制Venn圖獲得交集靶點。兩者的交集靶點即為上述芳香藥物治療流感的潛在靶點。

1.4 構建蛋白質相互作用(PPI)網(wǎng)絡圖

在STRING數(shù)據(jù)庫導入上述交集靶點，將蛋白質數(shù)據(jù)庫種類限定為智人，其他項目保留默認設置，繪制PPI網(wǎng)絡圖，將靶點間相互關系的數(shù)據(jù)結果以TSV文件格式保存，并應用Cytoscape3.7.2軟件中的“Network Analysis”功能加以分析。根據(jù)度值及介數(shù)值對節(jié)點進行篩選，將兩個參數(shù)都高于平均值的靶點選為關鍵靶點。將關鍵靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫構建PPI網(wǎng)絡。

1.5 繪制“中藥-有效成分-關鍵靶點”圖

利用Cytoscape3.7.2軟件將中藥名、有效成分及其潛在的作用靶點繪制成“中藥-有效成分-作用靶點”網(wǎng)絡圖。在網(wǎng)絡中，Degree值越大，則與該節(jié)點相關的節(jié)點越多。圖中的圖形大小與Degree值成正相關。

1.6 對關鍵靶點進行基因本體(GO)及基因組百科全書(KEGG)富集分析

在Metascape數(shù)據(jù)庫輸入關鍵靶基因，物種選擇為智人，對關鍵靶基因進行GO 富集分析與KEGG富集分析，分析關鍵靶點參與的生物學過程、細胞結構、分子功能及信號通路，并輸出結果。利用微生信網(wǎng)站(http：//www.bioinformatics.com.cn/)繪制相應的富集氣泡圖。

2 結果

2.1 藥物有效成分

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索獲得上述芳香藥物的成分共487個。根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18對成分進行篩選，剔除無效成分，共得到47個有效成分。將中藥及關鍵有效成分導入Cytoscape3.7.2軟件，采用網(wǎng)絡拓撲分析，通過介數(shù)中心排列，獲得其中最高的3種有效成分，分別為槲皮素(MOL000098，quercetin)、芫花素(MOL005573，Genkwanin)及木犀草素(MOL000006，luteolin)。

2.2 構建藥物-疾病靶點Venn圖

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索上述芳香藥物中化學成分的作用靶點，除去重復的靶點，共獲得224個藥物有效作用靶點。在 GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索流感相關作用靶點，并根據(jù)相關性得分對其進行篩選，得到作用靶點1 326個。對有效藥物作用靶點及流感相關作用靶點進行Venn分析，得出上述芳香藥物作用于流感的相關作用靶點78個。見圖1。

圖1 Venn圖

2.3 PPI網(wǎng)絡構建

將78個相關作用靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，建立靶點PPI網(wǎng)絡。在網(wǎng)絡中靶點間的相互作用關系由1 395條連線表示，線條越粗表示具有越強的相互作用，結果以TSV格式保存。

2.4 關鍵靶點篩選

在Cytoscape 3.7.2軟件中導入上述TSV格式文件，對網(wǎng)絡進行拓撲屬性的分析，度值的平均值為35.77，介數(shù)的平均值為7.23×10-3，篩出度值、介數(shù)值均高于平均值的靶點共24個。將篩選獲得的關鍵靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫構建PPI網(wǎng)絡圖(見圖2)。網(wǎng)絡中連接其他靶點較多的節(jié)點起關鍵作用。將甘露消毒丹中的芳香藥物及其含有的有效成分及24個關鍵靶點導入Cytoscape3.7.2軟件構建成“中藥-有效成分-關鍵靶點”交互作用網(wǎng)絡圖(見圖3)。圖3顯示出多個中藥作用于一個靶點、一個化學成分作用于多個靶點、多個中藥成分作用于一個靶點等特征，這表明甘露消毒丹中的芳香藥物是通過多成分、多靶點協(xié)同的作用達到防治流感的效果。

2.5 GO富集與KEGG通路富集分析

在Metascape數(shù)據(jù)庫輸入24個關鍵靶點，對其采取GO富集分析與KEGG富集分析。GO富集分析共獲得GO Biological Processes條目967條，GO Cellular Components條目28條，GO Molecular Functions條目46條，根據(jù)P<0.05，選取每種條目的前10條建立富集分析條形圖(見圖4)。KEGG富集分析共獲得相關分子通路114條，根據(jù)P<0.05，選取前20條的相關分子通路構建富集氣泡圖(見圖5)。

圖3 “中藥-有效成分-關鍵靶點”相互作用網(wǎng)絡

圖4 GO 富集條形圖

圖5 KEGG通路富集氣泡圖

3 討論

本課題得出甘露消毒丹中芳香藥物的有效化學成分45種，其中，槲皮素、芫花素、木犀草素最為關鍵。研究[3]發(fā)現(xiàn)，槲皮素能減少甲型H1N1病毒感染后Caspase-3蛋白的表達，從而減少細胞凋亡作用。實驗研究[3-4]表明，槲皮素能有效抑制流感病毒在呼吸系統(tǒng)的復制，降低肺部炎癥水平，提高巨噬細胞的吞噬能力，緩解血清中的炎癥狀態(tài)。芫花素具有抗炎作用及鎮(zhèn)痛作用[5]，能緩解流感的炎癥表現(xiàn)及周身酸痛的癥狀。木犀草素是一種天然類黃酮，具有調節(jié)免疫、抑制氧化、抗炎、抗病毒等多種功效，能通過調節(jié)TLR信號通路及凋亡相關因子的表達起到抗炎與抗流感病毒的作用，并能通過抑制細胞凋亡減少病毒的免疫損傷[6]。

對藥物與疾病的交集靶點進行篩選后共獲得關鍵靶點24個，涉及的靶點主要與流感病毒的感染、復制，以及炎癥反應的激活與調節(jié)有關。其中，IL-6、IL-8、TNF是流感病毒感染過程中單核細胞與巨噬細胞被激活產(chǎn)生的重要細胞因子，其功能主要是介導炎癥反應，造成炎癥損傷[7]。IL-6、TNF-α是重要的炎癥因子，能介導中性粒細胞中CD11b/CD18、CD11c/CD18表達水平的提高，并促進白細胞的炎癥滲出，還能作為內源性致熱源，作用于體溫調節(jié)中樞，從而引起發(fā)熱[8]。IL-10可通過減少促炎因子的釋放，減少過度炎癥反應造成的損傷[7]。IL1B的遺傳變異可能與流感的易感性相關[9]。CCL2是H7N9禽流感病毒感染后可介導包括急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)在內的急性肺損傷的重要蛋白[10]。CXCL8、IL-8在肺上皮細胞感染病毒后釋放，可能有利于吸引中性粒細胞以迅速清除壞死碎片，從而防止細菌感染發(fā)生[11]。表皮生長因子(EGFR)在IAV進入過程中不可或缺[12]。EGFR的下游信號可介導凝血途徑及肺B細胞下調，與高致病性流感感染的嚴重程度有關[13]。STAT1是流感病毒的早期復制及炎癥反應中的重要蛋白，并參與了病毒vRNA的合成[14]。JUN是編碼c-jun的基因[15]，c-jun可被JNK磷酸化，并與c-fos構成二聚體，即AP-1。轉錄因子活化蛋白-1 (Transcription factor AP-1)的表達可參與調節(jié)IL-6、IFN、ICAM1等多種細胞因子及炎癥介質的表達，在流感病毒感染早期有促進病毒感染及復制的作用[15-16]。Caspase-3 則是介導細胞調亡的關鍵蛋白[3]。

通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)，上述芳香藥物治療流感的基因功能主要涉及對氧化應激的反應、對活性氧的反應、對無機物質的反應、對脂多糖的反應、對細菌來源分子的反應等生物學過程，膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、囊泡腔、小窩、質膜筏等細胞結構，以及細胞因子受體結合、細胞因子活性、受體調節(jié)劑活性、核心啟動子結合、腫瘤壞死因子受體超家族結合等分子功能。這些生物學過程及分子功能多數(shù)與病原體引起的免疫反應及其介導的炎癥因子風暴關系密切。由KEGG通路富集分析得出，甘露消毒丹中芳香藥物治療流感的重要通路有IL-17信號通路、TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、MAPK信號通路、癌癥通路等，主要與病毒的感染、復制，以及炎癥反應的激活有關。其中，IL-17是一種由Th17細胞分泌的強炎癥因子，可介導多種炎癥因子及趨化因子的活化，并能通過促進腫瘤壞死因子的產(chǎn)生介導呼吸道平滑肌細胞分泌IL-6，激活中性粒細胞并使其成熟[17-18]。IL-17在炎癥細胞的組織浸潤及誘導肺部損傷中起重要作用[17]。流感病毒入侵呼吸道上皮細胞后介導促炎因子TNF-α的分泌，從而使IL-6的分泌也隨之增加，二者被認為是炎癥因子風暴中的關鍵節(jié)點[19]。TNF-α的增多可介導白細胞遷移、激活肺內皮細胞，并使粒細胞脫顆粒。IL-6可導致中性粒細胞與巨噬細胞增殖，介導更多炎癥因子產(chǎn)生，加重炎癥反應[19]。TLRs是一種最早發(fā)現(xiàn)的PRRs，可識別多種不同的病原體相關分子模式(Pathogen assciated molecular patterms，PAMPs)。肺內的巨噬細胞通過TLRs介導流感病毒ssDNA的識別，進而激活相關的抗病毒機制及免疫應答[20]。TLRs識別PAMPs后誘導Toll/白細胞介素1受體活化，并與髓樣分化因子(Myeloid differentiation factor88，MyD88)發(fā)生相互作用。MyD88能吸引白介素相關激酶4(Interleukin-1 receptor-associated kinase 4，IRAK-4)，與TLRs共同作用，誘導IRAK-1的活化，進而激活腫瘤壞死因子相關因子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)，并進一步導致IκB激酶與NF-κB活化[21]。被激活的下游轉錄因子與信號分子可介導微生物分子、細胞因子、趨化因子、共刺激分子的產(chǎn)生[21]。NOD樣受體(NODs)是一類主要存在于細胞胞漿中的重要PRRs，其中，NLR蛋白3是一種與病毒感染相關，且被深入研究的NOD樣受體。NLRP3炎癥小體是一種由NLRP3蛋白、ASC蛋白及Caspase-1前體構成的蛋白質復合體，能誘導Caspase-1前體的剪切與活化，進而將Pro-IL-1β、Pro-1L-18、Pro-IL-33活化為IL-1β、IL-18、IL-33[21]。NLRP3炎癥小體通路能造成細胞凋亡、介導級聯(lián)炎癥反應、引起細胞因子風暴[22]。MAPK信號通路的主要分支包括EBK、p38及JNK，研究[23]證實，三者都參與了病毒的傳播與復制。JNK蛋白磷酸化能介導下游AP-1轉錄因子c-jun與ATF2的活化，從而參與干擾素的形成，并且與細胞凋亡密切相關[23]。

綜上，甘露消毒丹中的芳香藥物治療流感的作用機制是一個多基因、多生物過程、多信號通路共同參與的過程，本課題預測了甘露消毒丹中的芳香藥物治療流感的相關分子靶點主要通過激活免疫系統(tǒng)、介導炎癥反應，并抑制過度的炎癥反應，從而達到抗病毒及減少免疫損傷的治療目的，為深入探討甘露消毒丹治療流感的作用機制，進一步開展有關的實驗研究提供了理論依據(jù)。