外感風(fēng)痧顆粒HPLC指紋圖譜研究

劉 云，覃潔萍，劉 雯*，周麗園

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 徐州 221002；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧 530001)

外感風(fēng)痧顆粒為國(guó)家頒布標(biāo)準(zhǔn)品種、廣西傳統(tǒng)特色優(yōu)勢(shì)壯藥，是廣西中醫(yī)藥大學(xué)百年樂制藥廠特色品種。外感風(fēng)痧顆粒由蒼耳草、崗梅、狗仔花、山芝麻、藤苦參、兩面針六味藥材配方而成，具有清熱、祛風(fēng)的功效，可用于咽喉腫痛、風(fēng)熱感冒等癥，療效顯著[1]。藥理研究表明外感風(fēng)痧顆粒具有明顯的抗菌、退熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、增強(qiáng)免疫功能等作用，且毒副作用低，具有很大的臨床應(yīng)用潛力[2-3]。長(zhǎng)期臨床試驗(yàn)和藥理試驗(yàn)證明外感風(fēng)痧顆粒按臨床擬用的劑量、途徑及療程使用安全有效[4-5]。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)組方中各藥材的成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)蒼耳草藥材的重要活性成分為酚酸類、蒽醌和黃酮類成分[6-8]；崗梅藥材中含三萜皂苷類、木脂素類、酚酸成分[9-11]；狗仔花中含有苯丙素類、甾體類、脂肪醇類、脂肪酸類成分[12-13]；山芝麻中含有三帖類、萘醌類、山芝麻醌類成分[14-15]；藤苦參中含強(qiáng)心苷類、生物堿類、萜類和酚酸類成分[15-16]；兩面針含有生物堿類、木脂素類、黃酮類、三萜類和酰胺類成分[17-18]。目前已有學(xué)者對(duì)外感風(fēng)痧顆粒的薄層鑒別和含量測(cè)定進(jìn)行研究[19]。本課題組先后建立了HPLC同時(shí)測(cè)定外感風(fēng)痧顆粒中4種組分[20]及9種組分的方法，本論文在前期研究的基礎(chǔ)上建立了外感風(fēng)痧顆粒的高效液相色譜指紋圖譜，為完善外感風(fēng)痧顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

e2695高效液相色譜儀(美國(guó)沃特世公司)；UPC-Ⅱ-10T純水儀(四川優(yōu)普超純科技有限公司)；KQ5200B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TGL-16B高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；PRACTUM224-1CN萬分之一電子分析天平(塞多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 材料

新綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)6630)，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)6361)，隱綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)3208)，均購(gòu)于上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，純度≥98.0%。咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)RP190614)，異槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)RP190404)，異綠原酸A標(biāo)準(zhǔn)品(RP180903)，異綠原酸B標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)RP180514)，異綠原酸C標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)RP180704)，均購(gòu)于成都麥德生科技有限公司，純度≥98.0%。乙腈為色譜純，其余均為分析純。

外感風(fēng)痧顆粒10個(gè)批次均產(chǎn)自廣西中醫(yī)藥大學(xué)百年樂制藥廠，批號(hào)分別為：20180101、20180402、20180403、20190302、20190303、20190401、20180304、20180401、20190301、20191001。

2 方法與結(jié)果

2.1 外感風(fēng)痧顆粒供試品溶液的制備

精密稱取外感風(fēng)痧顆粒粉末(20190303)約10.0 g，置具塞磨口錐形瓶中，精密量取25 mL甲醇加入具塞磨口錐形瓶中，精密稱定并記錄重量，超聲40 min，放涼，再稱定重量，并用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置，將上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 對(duì)照品溶液制備

分別精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C對(duì)照品各約3 mg，置于8個(gè)2 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。各取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量置于同一2 mL容量瓶中，加甲醇定容至2 mL，搖勻，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱：依利特Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；乙腈-0.2%磷酸系統(tǒng)梯度洗脫，程序見表1；檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm；流速0.8 mL/min；柱溫35 ℃。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密稱取外感風(fēng)痧顆粒粉末(20190303)約10.0 g，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣6次。記錄圖譜14個(gè)共有峰的保留時(shí)間和峰面積。以5號(hào)峰作為參照峰(S)，計(jì)算14個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果外感風(fēng)痧顆粒各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.3%，各峰相對(duì)峰面積RSD<2.3%，說明儀器精密度良好。

表1 梯度洗脫程序

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取外感風(fēng)痧顆粒粉末(20190303)約10.0 g，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3項(xiàng)下色譜條件，分別在放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后進(jìn)樣分析。以5號(hào)色譜峰為參照峰(S)，計(jì)算14個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果外感風(fēng)痧顆粒各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.8%，各峰相對(duì)峰面積RSD<3.0%，表明該方法制得的外感風(fēng)痧顆粒供試品溶液在室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取外感風(fēng)痧顆粒粉末(20190303)約10.0 g，平行6份，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以5號(hào)峰作為參照峰(S)，計(jì)算14個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果外感風(fēng)痧顆粒各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.1%，各峰相對(duì)峰面積RSD<2.8%，表明本實(shí)驗(yàn)所建立的方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜的建立

取10批外感風(fēng)痧顆粒樣品，按“2.1”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。將10個(gè)色譜圖分別導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)(V2012)軟件，以S5號(hào)樣品的色譜圖為參照，采用中位數(shù)相關(guān)系數(shù)法，設(shè)定時(shí)間窗為0.1 min，對(duì)色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正和匹配，建立外感風(fēng)痧顆粒的指紋圖譜，從中選擇了14個(gè)色譜峰作為外感風(fēng)痧顆粒的共有峰，結(jié)果見圖1。選擇色譜峰形及分離度良好的5號(hào)峰作為參照峰，計(jì)算14個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見表2、表3。

取對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，得到混合對(duì)照品溶液色譜圖。結(jié)合紫外光譜信息和混合對(duì)照品色譜圖并查閱相關(guān)文獻(xiàn)，初步指認(rèn)出外感風(fēng)痧顆粒指紋圖譜中8個(gè)共有峰，分別為新綠原酸(4號(hào)峰)、綠原酸(5號(hào)峰)、隱綠原酸(6號(hào)峰)、咖啡酸(7號(hào)峰)、異槲皮苷(9號(hào)峰)、異綠原酸B(10號(hào)峰)、異綠原酸A(11號(hào)峰)、異綠原酸C(12號(hào)峰)，結(jié)果見圖2、圖3。

2.6 相似度評(píng)價(jià)

將10批外感風(fēng)痧顆粒的色譜分別導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)(V2012)軟件進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果其相似度均大于0.9，見表4。結(jié)果表明不同批號(hào)的外感風(fēng)痧顆粒具有良好的相似性。

圖1 10批外感風(fēng)痧顆粒HPLC疊加圖

表2 10批外感風(fēng)痧顆粒14個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表3 10批外感風(fēng)痧顆粒指紋圖譜共有峰的相對(duì)峰面積

圖2 外感風(fēng)痧顆粒指紋圖譜的對(duì)照?qǐng)D譜(R)

圖3 混合對(duì)照品溶液的HPLC色譜

表4 外感風(fēng)痧顆粒HPLC色譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)分別考察了回流提取和超聲提取2種提取方法，考察了提取溶劑、提取時(shí)間、料液比，根據(jù)色譜圖的信息量和色譜峰峰面積，最終樣品提取方法確定為：10 g樣品加25 mL甲醇超聲40 min。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)液相條件進(jìn)行了優(yōu)化，分別考察了流動(dòng)相系統(tǒng)、柱溫、流速、檢測(cè)波長(zhǎng)，以色譜信息量、色譜峰形、峰面積以及相鄰色譜峰的分離度等為指標(biāo)，最終確定液相色譜條件為：乙腈-0.2%磷酸系統(tǒng)梯度洗脫，柱溫35 ℃，流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm。

4 結(jié)論

本文建立了外感風(fēng)痧顆粒HPLC指紋圖譜，提取了14個(gè)共有峰。文中指認(rèn)了8個(gè)共有峰，分別為新綠原酸(4號(hào)峰)、綠原酸(5號(hào)峰)、隱綠原酸(6號(hào)峰)、咖啡酸(7號(hào)峰)、異槲皮苷(9號(hào)峰)、異綠原酸B(10號(hào)峰)、異綠原酸A(11號(hào)峰)、異綠原酸C(12號(hào)峰)。由相似度評(píng)價(jià)結(jié)果可知，10批外感風(fēng)痧顆粒相似度均大于0.9，說明制備工藝合理穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)所建立的外感風(fēng)痧顆粒HPLC指紋圖譜分析方法簡(jiǎn)單方便、重復(fù)性好，可對(duì)外感風(fēng)痧顆粒進(jìn)行質(zhì)量控制，為外感風(fēng)痧顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和完善提供了一定的科學(xué)依據(jù)。