姜黃素PVP-EPO固體分散體在大鼠體內的藥物動力學考察

尹 麗，張純剛，周旖璇，張 強，程 嵐

(遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連 116620)

姜黃素是從姜科植物姜黃等的根莖中提取的一種天然黃色色素，也是一類酸性多酚類物質和生物活性化合物[1]，其主鏈為不飽和脂族及芳香族基團。幾個世紀以來，姜黃素在許多國家(尤其是東南亞和印度)常被用作烹飪香料、傳統藥物和染料[2]。經藥理研究表明，姜黃素有抗氧化、抗炎、抗凝、降脂、抗動脈粥樣硬化、抗衰老消除自由基及抑制腫瘤生長等作用[3-6]。另據研究，姜黃素的安全劑量高達12 g/d，是目前化學療法的理想替代品[7]。許多研究實體癌癥的學者對姜黃素產生了極大興趣，然而，姜黃素分子間和分子內氫鍵較強，在水介質中溶解度和溶解速率極低[8]；不過當姜黃素以晶體或溶液的形式存在時，極不穩定[9]，紫外線照射能迅速分解姜黃素。此外，姜黃素在胃腸道吸收后，通過一級代謝快速分解，大大降低了血漿中姜黃素的有效濃度[10]。為了提高姜黃素的溶出度，改善其生物利用度，學者們采用了固體分散技術[11-16]。不過已報道的固體分散體雖能夠提高生物利用度，但仍存在很多不足，如姜黃素-EPO固體分散體的溶液穩定性差，姜黃素-PVP固體分散體易吸濕而不穩定等[17]。為了解決這些問題，本實驗選擇使用EPO與PVP作為輔料，通過熱熔擠出技術制備姜黃素固體分散體，該技術在提高姜黃素溶解度和生物利用度的同時也增加了制劑的穩定性，現將實驗過程報道如下。

1 材料與儀器

1.1 儀器

LC-2010A高效液相色譜儀(日本島津公司)；UV1600紫外分光光度計(上海美普達儀器有限公司)；FA1004精密電子天平(天津天馬衡基儀器有限公司)；HX-C渦旋混合器(金壇區金城海瀾儀器制造廠)；TGL-16 g高速離心機；HAAKETMMiniCTW 錐形雙螺桿微量混合器(賽默飛世爾科技有限公司)；德國sartorius CP225D電子天平(深圳市朗普電子科技有限公司)；MTN-2800D氮吹儀(天津奧特賽恩斯)；電熱鼓風干燥機(天津市泰斯特儀器有限公司)；水浴鍋(鄭州博科儀器設備有限公司)。

1.2 藥品與試劑

姜黃素原料藥(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20141029)；姜黃素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110823-201004)；尼莫地平對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100270-201403)；聚乙烯吡咯烷酮PVP(北京邁瑞達科技有限公司)；聚丙烯酸樹脂EPO(德國贏創德固賽有限公司)；乙腈(瑞典歐森巴克化學公司，色譜級)；甲醇(瑞典歐森巴克化學公司，色譜級)；冰醋酸(天津市科密歐化學試劑有限公司，分析純)；乙酸乙酯(天津市科密歐化學試劑有限公司，分析純)；鹽酸(天津市科密歐化學試劑有限公司，分析純)；β-葡萄糖醛酸酶(Sigma-Aldrich中國)。

1.3 動物

健康SD雄性大鼠12只，體質量(250±20)g，由遼寧長生生物技術有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 固體分散體的制備

稱取一定質量比的EPO和PVP適量，將其溶于無水乙醇中，并攪拌至透明，蒸發除去乙醇后，放置于40 ℃真空干燥箱中干燥24 h，粉碎，過5號篩，得到粉末狀的混合輔料A，置干燥器內備用。

稱取一定質量比的姜黃素和混合輔料A于研缽中，混合均勻。在140 ℃、15 r/min的條件下，通過錐形雙螺旋微量混合器制備姜黃素固體分散體。

2.2 生物樣品中姜黃素的含量測定

2.2.1 姜黃素系列對照品溶液制備 精密稱取50 mg姜黃素對照品，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，配制成質量濃度為0.5 mg/mL的姜黃素貯備液。量取姜黃素儲備液適量，然后用甲醇稀釋成不同的質量濃度，分別制成濃度為20、100、200、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL的系列對照品溶液，于4 ℃條件下保存，備用[18]。

2.2.2 姜黃素系列質控標準溶液制備 精密量取姜黃素適量貯備液，然后用甲醇稀釋成低、中、高(100、500、2 000 ng/mL)三種不同質量濃度的姜黃素質控標準溶液，于4 ℃條件下保存，備用。

2.2.3 內標溶液制備 精密稱取適量尼莫地平對照品，加入甲醇溶解定容，制成質量濃度為5 mg/mL的內標貯備液。精密量取適量內標貯備液，加入甲醇稀釋定容，制成終濃度為0.5 mg/mL的內標溶液[19]。

2.2.4 色譜條件 色譜柱：Amethyst C18-H(4.6 mm×150 mm，5 μm)；預柱：Phenomenex C18(2.0 mm×4.0 mm，5 μm)；流動相：5%冰醋酸水溶液-乙腈(40∶60，V/V)；流速：1.0 mL/min；進樣量50 μL；檢測波長：427 nm；柱溫：30 ℃。

2.2.5 血漿樣品處理 空白血漿處理：取100 μL空白血漿，置于5.0 mL EP管中，依次加入10 μL標準品溶液，10 μL內標溶液，100 μL pH=5.0酸性溶液(酶活性最大)，渦旋1 min，再加入1 mL乙酸乙酯溶液，渦旋2 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液900 μL，置于1.5 mL EP管中，吹干后，加入80 μL流動相復溶，渦旋1 min，12 000 r/min離心10 min后，取上清液50 μL進樣分析。

血漿樣品處理：取100 μL血漿樣品，置于5.0 mL EP管中，加入100 μL pH=5.0酸性溶液(含1 000 μ β-葡萄糖醛酸酶)，渦旋1 min，在37 ℃的水浴鍋中孵化1 h，依次加入10 μL甲醇溶液，10 μL內標溶液，1 mL乙酸乙酯溶液，渦旋2 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液900 μL，置于1.5 mL EP管中，吹干后，加入80 μL流動相復溶，渦旋1 min，12 000 r/min離心10 min后，取上清液50 μL進樣分析。

2.2.6 專屬性考察 取100 μL空白血漿按“2.2.5”項下“空白血漿處理”的方法操作，將其中加入10 μL標準品溶液和10 μL內標溶液改為加入20 μL甲醇溶液，得到血漿樣品A；取100 μL空白血漿按“2.2.5”項下“血漿樣品處理”的方法操作，得到血漿樣品B；取“2.5”項下給藥后0.5 h大鼠血漿樣品，按“2.2.5”項下“血漿樣品處理”的方法操作，得到血漿樣品C。將上述血漿樣品A、B、C按“2.2.4”項下色譜條件進行測定。結果顯示，在該色譜條件下，姜黃素和內標的保留時間分別為4.013 min和6.432 min，兩者分離度良好，色譜見圖1。

2.2.7 標準曲線與定量下限考察 取空白血漿，按“2.2.5”項下“空白血漿處理”方法操作，制成不同質量濃度的標準血漿樣品，分別為2、10、20、50、100、200、500 ng/mL，按“2.2.4”項色譜條件下進行測定。以姜黃素質量濃度為橫坐標(x)，姜黃素與內標的峰面積之比為縱坐標(y)，制作標準曲線，通過加權最小二乘法進行回歸，回歸方程：y=0.017 4x-0.001 7，R2=0.998 5(r=0.999 2)，姜黃素質量濃度在2～500 ng/mL范圍內與峰面積的線性關系良好，定量下限為2 ng/mL。

2.2.8 精密度與準確度試驗 取低、中、高三種不同質量濃度(100、500、2 000 ng/mL)的質控標準溶液，按“2.2.5”項下“空白血漿處理”方法處理，在“2.2.4”項色譜條件下進行測定，記錄峰面積。每個質量濃度均制備6份平行樣品，連續測定3天，計算三種不同質量濃度的日內精密度、日間精密度、準確度。結果如下，日內精密度RSD分別為1.53%、1.72%、2.08%(n=6)；日間精密度RSD分別為1.30%、1.56%、1.50%(n=3)；準確度分別為(101.2±1.54)%、(102.1±1.76)%、(100.1±2.09)%(n=6)，均符合要求。

2.2.9 提取回收率 取低、中、高三種不同質量濃度(100、500、2 000 ng/mL)的質控標準溶液，按“2.2.5” 項下“空白血漿處理”方法處理，每個濃度均制備3份平行樣品，在“2.2.4”項色譜條件下進行測定，記其峰面積為A。另外取100 μL空白血漿于5 mL EP管中，依次加入20 μL甲醇、100 μL pH5.0溶液、1 mL乙酸乙酯，渦旋2 min，12 000 r/min離心10 min，去上清900 μL于1.5 mL EP管中，再加入相應質量濃度的姜黃素質控標準溶液和內標溶液，渦旋1 min，吹干后，加入80 μL流動相復溶，渦旋1 min，12 000 r/min離心10 min后，取上清液50 μL進樣分析，每個濃度均制備3份平行樣品，在“2.2.4”項色譜條件下進行測定，記其峰面積為B。通過兩者的比較，來計算姜黃素的提取回收率。結果如下：低、中、高三種不同質量濃度的提取回收率分別為85.0 %、89.2%、87.3%(n=3)，內標的提取回收率為87.0%(n=3)。

2.2.10 穩定性試驗 取低、中、高三種不同質量濃度的質控標準溶液(100、500、2 000 ng/mL)，按“2.2.5”項下“空白血漿處理”方法處理，每個質量濃度均制備3份平行樣品，分別考察室溫放置2 h，4 ℃放置24 h、凍融循環1次、凍融循環3次、-20 ℃放置30 d的穩定性。結果如下：血漿樣品在上述條件下的RE均在±15%內，結果見表1。

2.3 藥動學實驗

取健康SD雄性大鼠12只[體質量(250±20)g]，給藥前禁食12 h(水不限)，隨機分成兩組：一組為姜黃素原料藥，另一組為姜黃素制劑，采取灌胃給藥的方法，給藥量為50 mg/kg(以姜黃素原料藥計)。在給藥0、0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36 h后經眼眶取血0.5 mL，置于1.5 mL EP管中(肝素化)后，在12 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，于-20 ℃下保存備用。按“2.2.5”項下“血漿樣品處理”方法處理后，在“2.2.4”項下色譜條件測定不同時間血漿樣品中姜黃素的濃度，繪制藥-時曲線，采用DAS3.0軟件計算藥動學參數。藥動學參數見表2，藥-時曲線見圖2。

表2 姜黃素原料藥、姜黃素制劑在大鼠體內的藥動學參數

圖2 姜黃素原料藥、姜黃素制劑在大鼠體內的藥-時曲線

3 討論

本研究通過熱熔擠出技術制備姜黃素固體分散體，并建立HPLC法測定大鼠體內姜黃素的濃度，采用DAS3.0軟件計算藥動學參數，用于姜黃素在大鼠體內的藥代動力學研究。

相比于原料藥組，制劑組的達峰時間提前，且出現多峰現象。可能是由于制劑組中載體材料具有親水性，姜黃素的溶解度和溶出速度提高，當部分劑量從胃中排空到小腸中延遲時，則出現多峰現象。還有可能與姜黃素的肝腸循環有關。閆文麗等[20]研究證實姜黃素在腸道的吸收速率隨時間出現明顯的周期波動，且存在肝腸循環現象。本研究原料藥組多峰現象不明顯，可能是由于姜黃素自身的溶解度低，從胃中排空到小腸中，溶解度的增加不明顯，此現象需要進一步研究。制劑組Cmax(94.5±13.5 )ng/mL較原料藥Cmax(45.8±5.6) ng/mL提高206%，表明固體分散體組峰濃度較高，吸收情況較好。制劑組的AUC0～36 h(689.9±79.5) ngh/mL較姜黃素原料藥的AUC0～36 h(389.6±63.2)ngh/mL提高177%，說明將姜黃素制備成固體分散體時，生物利用度有所提高。其原因可能有：①姜黃素以非晶型狀態存在于固體分散體中，在溶出的過程中，溶出速率和溶出度都有較大程度的提高，進而提高了姜黃素的生物利用度；②姜黃素中的羥基基團可能與EPO及PVP中的羰基形成分子間的氫鍵，氫鍵的形成可使姜黃素在載體中保持非晶型狀態，并且由于載體材料的親水性，可以使姜黃素在介質中的過飽和狀態維持較長時間，進而增加藥物的吸收[21-22]。