溫補腎陽方通過ROS/p38 MAPK通路對骨髓增生異常綜合征細胞株自噬及凋亡的影響

趙志芳,趙志英,楊艷敏,席亞男,劉 泉

(1 邢臺醫學高等專科學校第一附屬醫院血液科,邢臺 054001;2 北京王府中西醫結合醫院腦病科;3 邢臺市人民醫院人事科;4 蘇州高新區人民醫院中醫科;*通訊作者,E-mail:214834294@qq.com)

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome,MDS)是一種老年人群常見的惡性血液系統疾病,其發病率有逐年升高的趨勢[1]。目前,去甲基化藥物和造血干細胞移植等是MDS治療的主要手段,但治療效果并不十分理想[2]。張新凡等[3]認為,脾腎虧虛是MDS發病的關鍵所在,給予溫陽補腎方治療后有良好的效果,但溫陽補腎方用于臨床治療MDS的理論依據還不夠充分。大量研究顯示,細胞凋亡和自噬異常是MDS發病的重要機制[4-6],然而,溫陽補腎方對MDS細胞凋亡和自噬的影響并不清楚。因此,本研究以不同濃度的溫陽補腎方含藥血清作用于人MDS細胞株SKM-1觀察SKM-1細胞凋亡和自噬的變化,旨在初步探討溫陽補腎方對SKM-1細胞的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

清潔級SD大鼠購于北京科宇動物養殖中心,(190-210)g,合格證號:SCXK(京)-2018-0010。人MDS細胞株SKM-1、活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)購于上海聯邁生物工程有限公司,貨號:LHY1465、LM-467D;RPMI-1640培養基、胎牛血清和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase-3)的比色檢測試劑盒購于上海索萊寶生物科技有限公司,貨號:31800-022、S9020、K106-100;噻唑藍[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]細胞增殖檢測試劑盒、膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)凋亡檢測試劑盒和通用總蛋白質提取試劑盒購于上海生工生物工程股份有限公司,貨號:E606334、E606336、C006225;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、Beclin1、P62、微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)、磷酸化(p)-P38 MAPK抗體購于美國Abcam,貨號:ab8245、ab62557、ab207305、ab62721、ab170099、ab178867。

1.2 溫陽補腎方含藥血清的制備

溫陽補腎方由黃芪(30 g)、黨參(20 g)、熟地(20 g)、山藥(15 g)、白術(15 g)、山茱萸(15 g)、淫羊藿(15 g)、菟絲子(15 g)、茯苓(15 g)、鎖陽(15 g)、當歸(10 g)組成,水煮成每毫升含生藥1 g。根據人和動物服用劑量換算,給予5 g/kg溫陽補腎方藥液灌胃的SD大鼠為低劑量組,給予10 g/kg溫陽補腎方藥液灌胃的SD大鼠為中劑量組,給予20 g/kg溫陽補腎方藥液灌胃的SD大鼠為高劑量組,給予等劑量生理鹽水灌胃的SD大鼠作為生理鹽水組,其中每組10只大鼠,每天早、晚各灌胃1次,持續7 d。在末次灌胃后2 h內腹腔注射10%水合氯醛麻醉取動脈血,2 000 r/min離心15 min分離獲得血清;經56 ℃滅活處理30 min并以0.22 μm微孔濾膜除菌后,保存于-20 ℃下備用。

1.3 實驗分組與處理

SKM-1細胞采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基在5%CO2、37 ℃恒溫培養箱內常規培養。實驗分為:空白對照組(不做任何處理)、生理鹽水組(給予生理鹽水組大鼠血清處理)、藥物低、中、高劑量組(分別給予相應劑量大鼠血清處理)。每個處理組設置3個復孔。

1.4 MTT法檢測SKM-1細胞增殖活力

以每孔2×104個細胞鋪96孔板后,置于5%CO2、37 ℃恒溫培養箱內培養;細胞貼壁后,按照1.3中的分組處理SKM-1細胞,另外將不含細胞的培養基作為調零組;處理24,48,72 h后,根據MTT細胞增殖檢測試劑盒說明檢測各處理組SKM-1細胞的光密度(optical density,OD)值,并以(實驗組OD-調零組OD)/(空白對照組OD-調零組OD)×100%值表示各組SKM-1細胞增殖活力。該實驗重復3次。

1.5 流式細胞術檢測SKM-1細胞凋亡

以每孔1×105個細胞鋪24孔板后,置于5%CO2、37 ℃恒溫培養箱內培養;細胞貼壁后,根據1.3中的分組處理各組SKM-1細胞48 h后收集各組細胞,參照Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒說明書檢測各組SKM-1細胞凋亡率。該實驗重復3次。

1.6 比色法檢測SKM-1細胞Caspase-3活性

按照1.3中的分組處理各組SKM-1細胞48 h后收集各組細胞,參照Caspase-3的比色檢測試劑盒說明書檢測各組SKM-1細胞Caspase-3活性。該實驗重復3次。

1.7 DCFH-DA熒光探針法檢測SKM-1細胞內ROS水平

以每孔2×105個細胞鋪6孔板后,置于5%CO2、37 ℃恒溫培養箱內培養;SKM-1細胞貼壁后,根據1.3進行分組處理;處理48 h后,參照ROS檢測試劑盒說明書檢測,熒光顯微鏡觀察、酶標儀檢測各處理組SKM-1細胞的熒光強度,該實驗重復3次。

1.8 免疫印跡法(Western blot)檢測SKM-1細胞中Beclin1、P62、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P38 MAPK和p-P38 MAPK蛋白表達水平

收集處理48 h的各組SKM-1細胞,根據通用總蛋白提取試劑盒說明書提取各組SKM-1細胞總蛋白后,采用考馬斯亮藍法檢測總蛋白濃度;對變性蛋白行電泳分離后,轉至聚偏氟乙烯膜上;經封閉處理2 h后,加入Beclin1(1 ∶800)、P62(1 ∶200)、LC3-Ⅰ(1 ∶500)、LC3-Ⅱ(1 ∶500)、P38 MAPK(1 ∶1 000)、p-P38 MAPK(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶1 000)抗體室溫孵育2 h;再以二抗(1 ∶2 000)孵育1.5 h后,暗室內顯影劑顯影曝光;采用凝膠成像分析系統分析SKM-1細胞中Beclin1、P62、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P38 MAPK和p-P38 MAPK蛋白表達水平,其中GAPDH作為內參進行校正。該實驗重復3次。

1.9 數據分析

2 結果

2.1 溫陽補腎方對SKM-1細胞增殖的影響

在相同時間處理下生理鹽水組和空白對照組之間SKM-1細胞增殖活力差異無統計學意義(P>0.05),但低劑量組、中劑量組和高劑量組SKM-1細胞增殖活力較生理鹽水組明顯降低(P<0.05),且呈一定的藥物濃度依賴性(P<0.05,見表1)。

表1 不同時間處理下各組SKM-1細胞的增殖活力

2.2 溫陽補腎方對SKM-1細胞凋亡的影響

與空白對照組比較,生理鹽水組SKM-1細胞凋亡率以及Caspase-3活性差異均無統計學意義(P>0.05);與生理鹽水組比較,低劑量組、中劑量組和高劑量組SKM-1細胞凋亡率以及Caspase-3活性逐漸升高且差異有統計學意義(P<0.05,見表2和圖1)。

表2 各組間SKM-1細胞凋亡率和Caspase-3活性的比較

2.3 溫陽補腎方對SKM-1細胞內ROS水平的影響

與空白對照組比較,生理鹽水組SKM-1細胞內ROS水平差異無統計學意義(P>0.05);與生理鹽水組比較,低劑量組、中劑量組和高劑量組SKM-1細胞內ROS水平逐漸升高,差異有統計學意義(P<0.05,見表3和圖2)。

圖1 流式細胞術檢測SKM-1細胞凋亡結果Figure 1 Flow cytometry analysis of SKM-1 cell apoptosis

2.4 溫陽補腎方對SKM-1細胞自噬和P38 MAPK通路的影響

與空白對照組比較,生理鹽水組SKM-1細胞中Beclin1、P62蛋白表達水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-P38 MAPK/P38 MAPK值差異均無統計學意義(P>0.05);與生理鹽水組比較,低劑量組、中劑量組和高劑量組SKM-1細胞中Beclin1蛋白表達水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-P38 MAPK/P38 MAPK值呈濃度依賴性升高,而P62蛋白表達水平呈濃度依賴性降低,差異有統計學意義(P<0.05,見圖3和表4)。

表3 各組SKM-1細胞內ROS水平的比較

圖2 DCFH-DA熒光探針法檢測SKM-1細胞內ROS水平 (×100)Figure 2 ROS level in SKM-1 cells by DCFH-DA fluorescent probe (×100)

圖3 Western blot檢測SKM-1細胞中Beclin1、P62、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和P38 MAPK蛋白表達Figure 3 Protein expression of Beclin1, P62, LC3-Ⅰ, LC3-Ⅱ and P38 MAPK in SKM-1 cells by Western blot

表4 各組SKM-1細胞中P62、Beclin1蛋白表達水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-P38 MAPK/P38 MAPK值的比較

3 討論

MDS是一種異質性髓系克隆性疾病,起源于造血干細胞,具有造血功能減低和向急性髓系白血病轉化風險高的特點[7];雖然去甲基化藥物、傳統化療藥和造血干細胞移植等使患者生存率有所提高,但因耐藥性和個體差異等因素導致部分患者的治療效果并不十分理想[8]。MDS在2008年被WHO血液腫瘤分類系統列為髓系腫瘤之一[9],細胞增殖與凋亡失衡以及自噬活性降低是導致MDS惡性發展的重要因素[10,11]。Caspase-3是一種半胱氨酸蛋白酶,在細胞凋亡過程中扮演著執行者的角色[12];P62是一種多功能蛋白,在自噬-溶酶體系統蛋白降解過程中發揮著重要作用[13];Beclin1是一種重要的自噬相關基因,可通過與相關蛋白結合形成復合體促進自噬發生[14];LC3也是一種自噬相關基因,可通過酶解變成LC3-Ⅰ,而LC3-Ⅰ可轉化為定位于自噬體膜的LC3-Ⅱ,其中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值常用來評價自噬水平[15,16]。

中醫將MDS稱為“髓毒勞”,認為“心生血,腎生髓”、“心陽不足,腎陽虧虛”。《醫宗金鑒》中言“黃芪補表氣”,故溫陽補腎方以黃芪、黨參、熟地為主藥,山藥、山茱萸輔之,加以白術、茯苓補氣健脾,淫羊藿、菟絲子、鎖陽溫腎填精,另外佐用當歸補養營血。全方健脾補腎、益髓填精、益氣生血。現代醫學研究表明,黃芪的主要化學成分黃芪多糖可誘導腫瘤細胞發生凋亡,可能是通過調控細胞凋亡相關蛋白表達、影響細胞生長周期發揮效用的[17]。黨參多糖能夠有效抑制人肝癌HepG2細胞的生長和運動能力,促進HepG2細胞凋亡[18]。梁穎等[19]使用熟地黃多糖對荷瘤小鼠進行治療,發現熟地黃多糖可上調腫瘤組織中Caspase-3的表達,促進腫瘤細胞凋亡。本研究以應用最為廣泛的MDS細胞株SKM-1為研究對象,給予溫陽補腎方含藥血清作用后發現,SKM-1細胞增殖活力及P62蛋白表達水平呈濃度依賴性降低,而細胞凋亡率、Caspase-3活性、Beclin1蛋白表達水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值呈濃度依賴性升高。結果表明,溫陽補腎方可抑制SKM-1細胞增殖,上調Caspase-3促進細胞凋亡,并且通過下調P62蛋白表達、上調Beclin1蛋白表達以及促進LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化,從而加速細胞自噬。

ROS是細胞內氧代謝的副產物,其過量可損壞蛋白質、脂質和DNA等,誘導細胞凋亡和自噬發生;p38 MAPK是絲氨酸/蘇氨酸絲裂原活化蛋白激酶家族成員,可被ROS活化,在細胞增殖、凋亡和自噬等過程中發揮著重要作用[20-23]。有研究指出,阿糖胞苷可通過上調ROS水平誘導人MDS細胞株MUTZ-8的生長并誘導其凋亡[24]。本研究進一步檢測發現,溫陽補腎方可呈濃度依賴性升高SKM-1細胞內ROS水平;另外,本研究還發現,溫陽補腎方可呈濃度依賴性上調P38 MAPK磷酸化水平。結果表明,溫陽補腎方可促進SKM-1細胞中ROS/P38 MAPK通路活化。提示,溫陽補腎方誘導SKM-1細胞凋亡與自噬的分子機制可能與其激活ROS/P38 MAPK通路有關。

總之,本研究發現了溫陽補腎方具有抑制SKM-1細胞增殖和促進凋亡與自噬的作用,初步揭示了其作用機制可能與激活ROS/p38 MAPK通路有關。該結果為后期進一步深入探討ROS/p38 MAPK通路和自噬在溫陽補腎方改善MDS方面的研究奠定了一定基礎。