環孢素治療兒童腎病綜合征的臨床效果觀察

曲英慧 周海瀾

聊城市第三人民醫院兒科，山東 252000

原發性腎病綜合征（primary nephrotic syndrome，PNS）屬于臨床常見的兒科疾病，占到所有腎病綜合征90%以上，患兒出現大量的蛋白尿、水腫和低蛋白血癥等體征，嚴重地影響了患兒生活質量與身心健康，研究發現該病的發生同免疫因素、環境和遺傳等因素均關系密切［1］。目前臨床治療PNS主要以激素治療為主，但是單一使用效果不好，而且不良反應較重，免疫抑制藥物治療也是重要手段，可以緩解蛋白尿體征，但是均由于存在嚴重的不良反應導致長期使用受到限制，環孢素A（cyclosporine A，CsA）為鈣調磷酸酶抑制劑類藥物，在改善腎臟疾病預后中具有重要意義，而且臨床聯合激素治療PNS報道較為少見［2］。Toll樣受體屬于人體重要跨膜蛋白，是天然免疫受體，可以對病原微生物分子模式識別，在免疫機能方面具有重要作用，同時能夠對獲得性免疫提供刺激信號，引導形成一系列免疫反應，但是在腎病綜合征患兒中以往報道少見［3］。本研究分析了CsA 治療PNS 患兒的療效及對Toll 樣受體（TLRs）表達的影響，以期為臨床提供指導和依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2016年1月至2018年12月腎病內科收治的100例PNS患兒，采用隨機數字表法分為研究組（潑尼松＋CsA）和對照組（潑尼松＋霉酚酸酯）各50例。（1）納入標準：①PNS患兒的診斷標準參考中華醫學會兒科學分會腎病學組制定的相關標準；②PNS患兒主要表現為大量蛋白尿：一周內3次尿蛋白定性達到或超過（+++）（++++），或者24 h尿蛋白定量達到或超過50.0 mg/kg；③低蛋白血癥（患兒血漿白蛋白＜25.0 g/L）；④治療前均行腎臟穿刺檢查確診；⑤患兒年齡范圍為3～14 歲；⑥治療前與患兒家屬簽署知情同意書。（2）排除標準：①腎臟腫瘤、結核；②先天性心臟?。虎圻z傳或染色體畸變；④患兒血肌酐（Cr）＞3.0 mg/dl；⑤患兒伴有嚴重的感染、肝功能障礙、血液系統疾病等；⑥對治療藥物具有嚴重的過敏反應；⑦狼瘡性腎炎、IgA腎病、紫癜性腎病等其他原因引起的腎臟疾病。研究組患兒中男32 例，女18 例；年齡范圍為2～14 歲，年齡（6.5±2.3）歲；病程范圍為3～36 個月，病程（14.2±7.9）個月；腎臟穿刺病理學：微小病變型26例、系膜增生性腎小球腎炎8例、局灶節段性腎小球硬化10例、膜增生性腎小球腎炎6例；治療前患兒尿蛋白排泄量為（93.2±33.1）mg（/kg·d）；中途有2 例患兒轉院治療。對照組患兒中男29 例，女21 例；年齡范圍為2～14 歲，年齡（6.4±3.0）歲；病程范圍為3～36 個月，病程（13.8±6.2）個月；腎臟穿刺病理學：微小病變型29 例、系膜增生性腎小球腎炎7 例、局灶節段性腎小球硬化7 例、膜增生性腎小球腎炎7例；治療前患兒尿蛋白排泄量為（96.0±35.0）mg（/kg·d）；有3例患兒因各種原因轉院或退出本研究。兩組患兒的年齡、性別等上述基線資料比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。本研究經本院醫學倫理委員會審批通過。

1.2 方法 （1）對照組：采用潑尼松（華中藥業股份有限公司生產，國藥準字H42021394，藥品批號：20180211）＋霉酚酸酯（上海羅氏制藥有限公司生產，國藥準字H20052237，藥品批號：20180305）治療，潑尼松口服，初始服用劑量為2 mg（/kg·d），最大劑量應低于60 mg/d，晨起服用，4～8 周后減量 2.5～5.0 mg，直至 0.5～1.0 mg/kg 維持治療3個月，隨后每周減量2.5～5.0 mg直至停藥。霉酚酸酯劑量20～30 mg（/kg·d），分為2次口服，連續服用1年。（2）研究組：采用潑尼松＋CsA（辰欣藥業股份有限公司生產，國藥準字H20113117，藥品批號：2018109）治療，潑尼松治療方法同對照組，CsA在患者開展激素治療第4周開始使用，劑量2～3 mg（/kg·d），血藥谷濃度維持在80～120 μg/L，連續服用1年。

1.3 實驗室指標檢測 抽取治療前后患兒空腹靜脈血4ml，在外周血單個核細胞中進行轉化生長因子β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）mRNA、白細胞介素 -18（IL-18）mRNA 提取，提取總RNA 后將反應物放置37 ℃水浴箱中孵育60 min，獲取反轉錄產物cDNA，采用RT-PCR 法進行監測，反應為美國應用生物系統公司制造生產的ABI 7500 熒光定量PCR 儀器操作，試劑盒由天根生化科（北京）有限公司生產。經抽取空腹靜脈血脫酶后置于無菌玻璃離心管，使用RNAiso Plus RNA 提取試劑盒提取單個核細胞總RNA，提取總RNA 后將反應物放置37 ℃水浴箱中孵育60 min，獲取反轉錄產物cDNA，樣本放至熱循環儀中，反應條件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s 4 ℃循環 1 次。反應完成后，再次將樣本放至冰中冷卻，RT-PCR 法測定Toll 樣受體 3（TLR3）mRNA、Toll 樣受體 9（TLR9）mRNA 水平，確認RT-PCR 的擴增曲線和融解曲線，計算相對表達量，試劑盒由天根生化科（北京）有限公司生產。

1.4 臨床療效評價 分別于治療3個月、6個月時檢測兩組患兒的臨床緩解率。（1）完全緩解評價標準：患兒臨床癥狀、體征完全消失，尿蛋白定性檢測連續3次轉陰（或者患兒24 h尿蛋白定量測定＜150 mg/d），人血白蛋白水平達到正常水平。（2）部分緩解判斷標準：治療后患兒的24 h尿蛋白定量較治療前下降＞50%、人血白蛋白水平上升定義為部分緩解；（3）24 h尿蛋白定量下降＜50%定義為未緩解。

1.5 統計學方法 統計分析采用SPSS 21.0軟件，兩組TLR3 mRNA、TLR9 mRNA 等計量資料符合正態分布以均數±標準差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；性別、療效、不良反應發生率等計數資料以例（%）表示，采用χ2檢驗或非參數檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組患兒TLR3 mRNA、TLR9 mRNA 表達水平比較 治療前，研究組和對照組患兒TLR3 mRNA、TLR9 mRNA 水平比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）；治療后，研究組的TLR3 mRNA、TLR9 mRNA 表達水平均低于對照組（均P＜0.05），具體見表1。

2.2 兩組患兒TGF-β1 mRNA、IL-18 mRNA表達水平比較 治療前，兩組患兒TGF-β1 mRNA、IL-18 mRNA 水平比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）；治療后，研究組的TGF-β1 mRNA表達水平低于對照組（P＜0.05），見表2。

2.3 兩組患兒臨床療效比較 在治療3 個月后，研究組患兒的整體療效分布優于對照組（Z=-2.070，P=0.038）；但是在治療6 個月后，研究組和對照組患兒的整體療效分布比較差異無統計學意義（Z=-0.951，P=0.342），詳見表3。

表1 兩組原發性腎病綜合征患兒TLR3 mRNA、TLR9 mRNA表達水平比較（/βactin，）

表1 兩組原發性腎病綜合征患兒TLR3 mRNA、TLR9 mRNA表達水平比較（/βactin，）

注：對照組采用潑尼松＋霉酚酸酯治療，研究組采用潑尼松＋環孢素A治療；TLR3為Toll樣受體3，TLR9為Toll樣受體9

組別研究組對照組t值P值例數 4 8 TLR3 mRNA治療前0.967±0.241 1.004±0.275-0.698 0.487 47治療后0.501±0.116 0.648±0.150-5.350＜0.001 TLR9 mRNA治療前1.983±0.447 1.890±0.433 1.030 0.306治療后1.332±0.260 1.476±0.258-2.709 0.008

表2 兩組原發性腎病綜合征患兒TGF-β1 mRNA、IL-18 mRNA表達水平比較（/βactin，）

表2 兩組原發性腎病綜合征患兒TGF-β1 mRNA、IL-18 mRNA表達水平比較（/βactin，）

注：對照組采用潑尼松＋霉酚酸酯治療，研究組采用潑尼松＋環孢素 A 治療；TGF-β1 為轉化生長因子 β1，IL-18 為白細胞介素-18

治療后0.078±0.024 0.083±0.027-0.954 0.342組別研究組對照組t值P值例數 4 8治療后0.153±0.051 0.178±0.048-2.459 0.016 TGF-β1 mRNA治療前0.331±0.084 0.347±0.090-0.896 0.373 47 IL-18 mRNA治療前0.173±0.052 0.168±0.050 0.478 0.634

表3 兩組原發性腎病綜合征患兒臨床療效比較[例（%）]

2.4 兩組患兒的人血白蛋白、膽固醇水平比較 治療前，兩組患兒的人血白蛋白、膽固醇水平比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）；治療后，研究組的膽固醇水平低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），詳見表4。

表4 兩組原發性腎病綜合征患兒的人血白蛋白、膽固醇水平比較（）

表4 兩組原發性腎病綜合征患兒的人血白蛋白、膽固醇水平比較（）

注：對照組采用潑尼松＋霉酚酸酯治療，研究組采用潑尼松＋環孢素A治療

治療后4.20±0.85 4.56±0.78-2.150 0.034組別研究組對照組t值P值例數48 47人血白蛋白（g/L）治療前24.11±3.02 25.20±2.96-1.776 0.079治療后39.75±3.30 38.81±3.42 1.363 0.176膽固醇（mmol/L）治療前9.41±1.86 9.20±1.93 0.540 0.590

2.5 兩組患兒不良反應發生情況比較 治療后，研究組的胃腸道不適、并發感染、多毛、齒齦增生發生率與對照組比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表5。

表5 兩組原發性腎病綜合征患兒不良反應發生情況比較[例（%）]

3 討 論

腎病綜合征屬于臨床常見的兒科系統疾病，患兒由于腎小球濾過膜的通透性增加造成了大量的血漿蛋白從尿液中流失同時引發了一系列病理生理變化，PNS 屬于最為常見的類型之一，超過90%以上，而且病程遷延，極易復發，嚴重地影響了兒童身心健康與生活質量［3］。目前認為引發腎病綜合征發生的因素較多，一方面和細胞免疫有關，T 淋巴細胞是機體細胞免疫中最為主要的細胞，具有高度異質性，動物實驗證實Th1 細胞參與的免疫反應主要與伴細胞增生與新月體形成有關［4-5］；生理狀態下人體Th1 產生的細胞因子 IFN-γ 能夠抑制 Th2 應答 ，Th2 細胞形成細胞因子IL-10 能夠阻斷Th1 細胞的活化，兩種細胞的相互平衡制約共同維持內環境穩定，一旦失去平衡則內環境失去穩態導致疾病發生［6］。另一方面研究發現腎臟固有細胞主要為內皮細胞、足細胞以及腎小管上皮細胞，足細胞可以參與疾病發生，足細胞能夠高度分化形成指突狀的足突，鄰近的足突之間由裂孔膜連接并緊貼在毛細血管基底膜的外側，可以抵消腎小球基底膜膨出穩定腎小球結果，同時可以合成血管內皮生長因子維持腎臟血管濾過屏障功能，一旦足細胞損傷則血管內皮生長因子表達升高，腎臟固有細胞包括內皮細胞、系膜細胞、足細胞和腎小管上皮細胞等，研究認為足突回縮導致蛋白尿形成［7-8］。此外原位免疫復合物也會介導腎臟受損，一般情況原位免疫復合物很少進入到循環，在血流緩慢的位置沉積，腎小球系膜細胞表面存在的抗原同機體血液循環中的抗體與腎小球固有抗原相結合后沉積在腎臟系膜區后形成了原位免疫復合物，進而激活補體誘導嗜堿粒細胞釋放血管活性物質進而增高血管壁的通透性，還可以釋放組胺吸引中性粒細胞聚集于免疫復合物周圍，最終沉積于內皮細胞與基底膜，促進了腎病綜合征發生和發展［9-10］。

目前臨床治療原發性腎病綜合主要以激素治療為主，但是不良反應多，效果不佳，因此主要通過采取免疫抑制劑開展治療，傳統的免疫抑制藥物副反應較大，一旦劑量過大還會引發遠期不良反應增加［11］。本研究中治療3 個月后，研究組患兒的整體療效分布優于對照組，說明在短期內采用CsA 聯合激素治療PNS 患兒效果顯著。這主要是和CsA可以參與T 淋巴細胞活化機制有關，該藥物可以通過與細胞漿中的CsA 受體結合抑制鈣調磷酸酶的磷酸化酶活性，進而造成了CD4+T 淋巴細胞胞漿內信號傳導途徑被抑制，下調細胞因子表達，同時可以糾正T 淋巴細胞比例失衡［12-13］。本研究還發現治療后，研究組的人血白蛋白高于對照組，膽固醇水平則低于對照組，說明采用CsA 聯合激素治療PNS 患兒可以提升白蛋白濃度，降低膽固醇濃度。這主要是由于CsA 可以恢復足細胞細胞骨架的穩定性并減少蛋白尿形成，同時還可以逆轉血小板活化因子對腎小球上皮細胞合成蛋白多糖的抑制，因此可以增加腎小球上皮細胞分泌硫酸類肝素和蛋白多糖形成，提升了腎小球基底膜的孔徑選擇性和電荷選擇性，降低分流濾過，促進足突重建［14-15］。在使用CsA 應用過程中需要關注腎臟毒性，一般呈現劑量依賴性，在減量后可以恢復，其余常見的不良反應包括面部多毛、輕度高血壓、呼吸道感染，少數出現肝功能異常、齒齦增生和胃腸道反應，通過開展對癥處理后均無異常。研究組的胃腸道不適、并發感染、多毛表現、齒齦增生發生率與對照組比較，差異均無統計學意義，說明采用CsA聯合激素治療PNS患兒不會增加不良反應，應用較為安全。目前建議在開展CsA 治療中應定期檢測藥物谷濃度，讓血藥谷濃度維持在100～200 μg/L，既可以確保藥物治療效果，同時也減少了不良反應發生［16］。

本研究分析了TLR3 mRNA、TLR9 mRNA變化，T淋巴細胞屬于人體細胞免疫主要細胞，其中調節性T細胞參與了PNS發生和發展過程，具有維持自身免疫耐受和避免免疫損傷機體功能，但是在多種自身免疫性疾病發展中具有重要作用［17］。本研究發現治療后，研究組的TLR3 mRNA、TLR9 mRNA表達水平均低于對照組，說明采用CsA聯合激素治療PNS患兒可以降低 TLR3 mRNA、TLR9 mRNA 表達水平，提示 PNS 發生同TLR3、TLR9 異常活化有關，通過降低 TLR3 mRNA、TLR9 mRNA表達可以減輕患者臨床體征。TLRs存在于人體的單核細胞、樹突狀細胞等免疫細胞中，可以參與天然免疫反應和獲得性免疫反應，發揮介導炎癥反應作用，對病原微生物的侵襲發揮抵御作用，同時機體抗原呈遞細胞如樹突細胞借助其表達TLRs識別脂多糖，造成樹突細胞被活化而成熟，提供獲得性免疫共刺激信號［18］。TLR3 信號通路可以介導炎癥反應；而TLR9則和腎臟損傷有關，通過激活細胞轉錄因子及黏膜免疫，造成免疫復合物在腎臟沉積，致使足細胞損傷及腎小球基質擴張，形成蛋白尿及血尿，揭示了PNS發病機制以及CsA治療的途徑［19］。本研究還發現治療后，研究組的TGF-β1 mRNA表達水平均低于對照組，說明采用CsA聯合激素治療PNS患兒可以抑制患兒體內炎癥反應程度。轉化生長因子-β則在出現腎小球硬化患者中表達顯著增加，會刺激腎臟局部T細胞發生轉化，誘導腎臟微環境炎癥因子增多，導致腎臟形成慢性炎癥損傷［20］。

本研究優勢在于證實了CsA 聯合激素治療PNS 患兒效果較好，同以往研究類似，但是本研究同時發現了該方案在改善患兒白蛋白濃度和降低血脂方面效果顯著，而且初步闡述了發揮治療作用同調節TLR3、TLR9 異常活化關系密切。但是本研究隨訪時間短，入組患者數量較少，而且各指標監測過程中受到的影響因素較多，可能導致數據存在偏倚，因此還需長期隨訪、擴充樣本量深入觀察。

綜上所述，激素＋CsA 較激素＋霉酚酸酯治療PNS 患兒對TLR3 mRNA、TLR9 mRNA、TGF-β1mRNA 的調節作用更顯著，早期臨床效果更好。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。