HER-2染色在兩種不同免疫組化染色平臺結果不一致的分析

申敬偉 董芳莉 楊海軍

安陽市腫瘤醫院病理中心，河南 455000

人表皮生長因子受體-2（HER-2）是定位于染色體17q12-21，32 上的原癌基因-人表皮生長因子受體2 基因（C-erbB-2 基因）編碼的相對分子質量為185 000 的跨膜受體樣蛋白，具有酪氨酸激酶活性。該蛋白結構分為3 個部分：胞外區域（ECD）、跨膜區域與胞內酪氨酸激酶區域。正確檢測和評定乳腺癌和胃癌的HER-2 蛋白表達和基因擴增狀態對乳腺癌和胃癌的臨床治療及預后判讀至關重要［1-3］。目前對HER-2表達評估的金標準是組織學方法，即通過免疫組化（IHC）或熒光原位雜交（FISH）技術對患者的組織標本進行檢測，免疫組化作為評價HER-2 蛋白狀態簡便且實用的方法被廣泛應用。近年全自動免疫組化染色平臺的應用在免疫組化染色的標準化控制中起重要作用［4］，但不同免疫組化染色平臺染色效果存在一定的差異。本實驗將HER-2 抗體在兩種不同免疫組化染色平臺結果不一致的原因分析報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集2019 年1—9 月本院病理科存檔的腫瘤標本40例，其中浸潤型乳腺癌25例，胃腺癌15例。

1.2 儀器與試劑 美國Roche Ventana XT 全自動免疫組化儀；德國Leica Bond Max 全自動免疫組化儀；Leica RM2235型石蠟切片機；德國Leica 顯微鏡；HER-2抗體（4B5，工作液）為美國Roche公司產品；Roche封閉式二抗系統；Leica封閉式二抗系統。

1.3 方法 蠟塊連續3 μm切片2張，分別用貼置Roche、Leica標簽的防脫載玻片撈片，添加陽性對照組織，70 ℃烤片50 min，羅氏標簽的玻片牛奶浸泡15 min，分別上機全自動處理。Roche Ventana和Leica Bond全自動免疫組化染色平臺均使用Roche公司的HER-2抗體（4B5，工作液），同一批號，分別使用各自封閉的二抗系統。兩種染色平臺使用各自的標準化SOP操作流程。染色結果在顯微鏡下觀察對比。

1.4 判讀標準 （1）乳腺癌HER-2免疫組化判讀參照我國乳腺癌HER-2 檢測指南（2019 版）［2］，0：陰性，無染色或≤10%的浸潤癌細胞呈現不完整的、微弱的細胞膜染色；1+：陰性，＞10%的浸潤癌細胞呈現不完整的、微弱的細胞膜染色；2+：不確定，＞10%的浸潤癌細胞呈現弱到中等強度的、完整細胞膜染色或≤10%的浸潤癌細胞呈現強而完整的細胞膜染色；3+：陽性，＞10%的浸潤癌細胞呈現強、完整、均勻的細胞膜染色。（2）胃癌HER-2 免疫組化判讀參照我國胃癌HER-2 檢測指南（2011 版）［5］，0：陰性，無反應或＜10%腫瘤細胞膜染色；1+：陰性，≥10%腫瘤細胞微弱或隱約可見細胞膜染色；僅有部分細胞膜染色；2+：不確定，≥10%腫瘤細胞有弱到中度的基底側膜、側膜或完全性細胞膜染色；3+：陽性，≥10%腫瘤細胞基底側膜、側膜或完全性細胞膜強染色。

2 結 果

2.1 浸潤性乳腺癌HER-2 在兩種全自動免疫組化儀的染色結果 25 例浸潤性乳腺癌HER-2 在Roche Ventana XT 和Leica Bond Max 全自動免疫組化的染色結果比較差異有統計學意義（P＜0.05），Kappa 值0.135，一致性較差，具體見表1及圖1～2。

表1 25例浸潤性乳腺癌HER-2在兩種全自動免疫組化儀的染色結果（n）

2.2 胃癌HER-2 在兩種全自動免疫組化儀的染色結果 15例胃癌HER-2在Roche Ventana XT和Leica Bond Max全自動免疫組化儀的染色結果比較差異無統計學意義（P＞0.05），Kappa值0.186，一致性較差，具體見表2及圖3～4。

表2 15例胃癌HER-2在兩種全自動免疫組化儀的染色結果（n）

3 討 論

正確檢測和評定乳腺癌和胃癌的HER-2 蛋白表達和基因擴增狀態對乳腺癌和胃癌的臨床治療及預后判斷至關重要［3，6］，因此，HER-2 檢測結果的準確性和可重復性非常重要。全自動免疫組化染色平臺在免疫組化技術中應用廣泛，染色結果可靠，操作簡單，背景清晰，染色效果更佳［7］。本實驗室一直使用Roche Ventana XT 染色平臺進行HER-2（4B5）檢測，染色效果滿意。HER-2（4B5）抗體含有足夠50 次試驗的試劑，50 次用完后試劑瓶里還存有1 ml左右的試劑量，殘存的試劑在Leica Bond Max 染色平臺進行HER-2（4B5）檢測，未達到理想效果。本實驗室發現HER-2（4B5）在Roche Ventana XT 染色平臺效果優于 Leica Bond Max，25 例浸潤性乳腺癌 HER-2 在 Roche Ventana XT和Leica Bond Max 全自動免疫組化儀的染色結果比較差異有統計學意義（P＜0.05），Kappa值0.135，一致性較差；15例胃癌 HER-2 在 Roche Ventana XT 和 Leica Bond Max 全自動免疫組化儀的染色結果比較差異無統計學意義（P＞0.05），但是Kappa 值0.186，一致性較差。可能原因是樣本例數較少，有待后續實驗增加樣本例數進行驗證。

HER-2（4B5）抗體是一種兔單克隆抗體，與石蠟包埋的組織切片中的HER-2 相結合。使用可識別兔免疫球蛋白的生物素結合二抗，使用二抗HRP 結合物對特異性抗體進行定位。隨后通過酶反應底物的沉淀使特異性抗體-酶復合物顯色。Roche 封閉式二抗系統即Ultra View Universal DAB Detection Kit 含有HRP 標記的抗體混合物（山羊抗小鼠IgG，山羊抗小鼠IgM 和山羊抗兔）。Leica 封閉式二抗系統即Bond Polymer Refine Detection 含有抗兔多聚物HRP-IgG。 HER-2（4B5）工 作 液 和 Roche 二 抗 系 統 是Ventana XT 的封閉式一抗和二抗，兩者匹配運用于Roche Ventana XT 染色平臺，效果最優。HER-2（4B5）工作液用于Leica Bond Max 染色平臺屬于開放型一抗，需要用Bond 一抗稀釋液稀釋到合適的濃度，才能結合Bond Polymer Refine Detection 達到最優化的使用條件。本實驗直接使用HER-2（4B5）工作液用于Leica Bond Max 染色平臺，出現3+陽性例數增多和染色過深，可能和一抗的濃度有關。

決定免疫組化染色效果的重要因素是抗原修復，腫瘤標本經10%中性福爾馬林固定和石蠟包埋后，大量蛋白相互交聯，抗原修復打開交聯的蛋白，暴露抗原［8］。合適的修復液是影響抗原修復效果的重要因素，Roche Ventana XT 抗原修復液pH 8.0～8.5，Leica Bond Max 抗原修復液pH 9.0。本實驗HER-2（4B5）工作液用于Leica Bond Max 染色平臺2+和3+結果多于Roche Ventana XT 染色平臺，其中2 例染色比陽性對照組織染色深，非特異背景增加，可能與高pH值抗原修復液有關。在實際工作中，抗原有最合適的pH 值范圍。因為組織經固定、包埋后抗原表面所帶電荷發生改變，從而影響抗原與抗體的結合，在一定pH 值修復液中進行修復，會恢復抗原表面原來的帶電荷狀態，達到最佳染色效果［9］。

圖1 Roche Ventana XT 染色平臺浸潤型乳腺癌2+（HER-2 ×20） 圖2 Leica Bond Max 染色平臺浸潤型乳腺癌3+（HER-2 ×20） 圖3 Roche Ventana XT 染色平臺胃癌2+（HER-2 ×20） 圖4 Leica Bond Max 染色平臺胃癌3+（HER-2 ×20）

決定免疫組化染色效果的另一重要因素是一抗的染色，兩種免疫組化染色平臺的技術原理不同，Roche Ventana XT 采用液體封蓋膜技術，防止試劑揮發，同時采用空氣渦流技術混勻試劑，一抗受到稀釋，達到最佳濃度。Leica Bond Max 采用Covertiles 技術，試劑側面微量泵抽吸，直接滴加在組織表面，抗原抗體結合，對于開放性一抗，如果沒有稀釋，濃度偏高，影響染色結果。

綜上所述，不同的免疫組化染色平臺的技術原理及配套的封閉試劑不同，其染色效果液存在一定差異。因此，為了提高病理切片質量，推進規范化操作流程，針對不同的抗體選用合適的染色平臺。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。