人臍帶間充質(zhì)干細胞對高濃度葡萄糖誘導的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞自噬水平的影響及其機制

閆 瑾,李 蓉,王 莉,張桂鷗,楊 揚,劉文蘭,朱 丹

(1 西安醫(yī)學院醫(yī)學技術學院眼視光教研室,西安 710021;2 西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院眼科;3 空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院眼科,全軍眼科研究所;*通訊作者,E-mail:rechelrong198222@163.com)

1 材料與方法

1.1 材料

經(jīng)產(chǎn)婦本人及家屬簽署臍帶用于實驗研究的知情同意書后,取2018-2019年出生的健康足月嬰兒臍帶。人ARPE-19株(武漢普諾賽生命科技有限公司);DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶及胎牛血清(美國Gibco公司);兔多抗自噬標志性蛋白微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-related protein 1 light chain 3,LC3)B(Ab48394)、兔單抗CD90(ab133350)(英國abcam公司);兔多抗Beclin-1(3495S)、兔多抗p-mTOR(5536)(美國CST公司);兔多抗P62(AF5384,美國Affinity Biosciences公司);兔多抗mTOR(20657-1-AP,武漢三鷹生物技術有限公司);兔多抗GAPDH(AB-P-R 001,杭州賢至生物有限公司);HRP標記羊抗兔二抗(BA1054,武漢博士德生物工程有限公司);噻唑蘭MTT(3580MG250,德國BIOFROX公司);人VEGF ELISA試劑盒(Human VEGF-A ELISA Kit E-EL-H0111c武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司);FACS-Calibur流式細胞儀(美國Becton Dikinson公司);倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司,型號ECLIPSE Ts2);微型高速離心機(美國Labnet公司,型號C2500-R-230V);全自動酶標儀(美國Thermo scientific公司,型號mμlISKANMK3);透射電子顯微鏡(日本HITACHI公司,型號HT7700-SS)。

1.2 方法

1.2.1 hUCMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定 組織塊貼壁法分離培養(yǎng)hUCMSCs[14]。組織塊附著后添加含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基,每隔3 d換液,待細胞融合達80%-90%時,用0.25%胰蛋白酶消化傳代,比例為1 ∶3。hUCMSCs細胞傳代至第3代,參照文獻[15]的方法,胰酶消化,PBS重懸,按照使用說明書加入小鼠抗人CD90單克隆抗體,避光孵育后流式細胞儀檢測。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及分組 選用DMEM/F12(含10% FBS+1%青霉素和鏈霉素)培養(yǎng)液,在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)ARPE-19細胞,實驗選用處于對數(shù)生長期的第5-10代細胞,按照5.0×105個/孔傳代于6孔板內(nèi),隨機分為對照組(PBS)、高糖組(25 mmol/L D-glucose)和高糖+hUMSCs組。……