丁卡因通過MDM2基因下調(diào)Survivin蛋白抑制黑色素瘤生長

伍春林,易 鵬,黃 祥,馮建國,姜 鮮,2*

(1 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，瀘州 646000；2 瀘州市人民醫(yī)院麻醉科;*通訊作者,E-mail:jiangkeke303@163.com)

黑色素瘤是一種侵襲性極強的惡性腫瘤，是發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一[1]。臨床研究表明，早發(fā)現(xiàn)并盡早進(jìn)行手術(shù)切除是治療黑色素瘤的最佳選擇[2]。而術(shù)后原發(fā)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是患者預(yù)后不良的主要原因[3]。回顧性研究表明，局麻藥的使用在減少術(shù)后原發(fā)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中起到積極的作用[4,5]。大量的證據(jù)也表明局麻藥可以通過直接細(xì)胞毒性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制增殖、遷移和侵襲，以及通過甲基化調(diào)節(jié)基因表達(dá)等表現(xiàn)出顯著的腫瘤抑制作用[6]。局麻藥可通過多種作用機制抑制癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，并隨局麻藥的種類、濃度及癌細(xì)胞類型而不同[7]，因此局麻藥抑制腫瘤的分子機制還需深入探究。Werdehausen等[8]和Kobayashi等[9]的研究表明丁卡因似乎具有較強的腫瘤抑制效力。而目前關(guān)于丁卡因?qū)δ[瘤作用的研究較少，且缺乏機制研究。為此，本研究就局麻藥丁卡因?qū)谏亓錾L的影響及機制展開研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 鹽酸丁卡因(天興)，溶于無菌生理鹽水中配置成0.2 mol/L的母液，隨后根據(jù)實驗需求用細(xì)胞培養(yǎng)基配成0，0.1，0.15，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mmol/L的培養(yǎng)液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清、高糖DMEM(美國Hyclone)，MTT試劑、BCA試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，MDM2抗體(美國Santa)，Survivin抗體(中國ZEN BIO公司)，GAPDH抗體(中國Proteintech公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific)，全自動酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek)，電泳儀、濕轉(zhuǎn)槽(美國Bio-RAD)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A375和B16黑色素瘤細(xì)胞為西南醫(yī)科大學(xué)麻醉實驗室常規(guī)保存。A375和B16均采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)，單層貼壁培養(yǎng)于CO2培養(yǎng)箱中(37℃，5%CO2)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時進(jìn)行實驗。

1.2.2 MTT法檢測丁卡因?qū)谏亓黾?xì)胞活力的影響 取對數(shù)生長期的黑色素瘤細(xì)胞(A375和B16)，胰酶消化、細(xì)胞計數(shù)后，A375(3×104個/ml)和B16(1×104個/ml)接種于96孔板，每孔100 μl。過夜后，A375細(xì)胞予以0，0.3，0.4，0.5，0.6 mmol/L丁卡因干預(yù)24 h；B16細(xì)胞則予以0，0.1，0.15，0.2，0.3 mmol/L丁卡因處理24 h。小心吸棄上清液，每孔加入100 μl含10 μl MTT的新鮮培養(yǎng)液，4 h后更換為100 μl二甲基亞砜孵育15 min。用酶標(biāo)儀測量560 nm處的光密度值(optical density，OD)，認(rèn)為0 mmol/L組的細(xì)胞活力為100%，作為對照，抑制率=(1-丁卡因組OD560/對照組OD560)×100%，計算IC50。

1.2.3 細(xì)胞集落實驗檢測丁卡因?qū)谏亓鲈鲋衬芰Φ挠绊?將生長良好的A375和B16細(xì)胞均勻接種于6 cm培養(yǎng)皿(A375：1×103個/皿，B16：600個/皿)，隨機分為對照組、丁卡因0.05 mmol/L組、丁卡因0.10 mmol/L組、丁卡因0.15 mmol/L組，相應(yīng)地予丁卡因0，0.05，0.10，0.15 mmol/L干預(yù)24 h后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)待集落形成，結(jié)晶紫染液染色后計數(shù)集落(大于或等于50個細(xì)胞的集落)。

1.2.4 Western blot檢測Survivin及MDM2的表達(dá)水平 取融合度約為70%-80%的黑色素瘤細(xì)胞A375和B16，予丁卡因處理24 h(根據(jù)1.2.2中IC50結(jié)果，A375細(xì)胞予0.4 mmol/L丁卡因，B16細(xì)胞予0.2 mmol/L丁卡因)，對照組給予等體積生理鹽水處理24 h。用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取蛋白，BCA蛋白定量后制備蛋白樣品。經(jīng)12% SDS-PAGE凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)至NC膜，在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h，隨后洗膜并轉(zhuǎn)入相應(yīng)一抗中(Survivin 1 ∶1 000、MDM2 1 ∶200、GAPDH 1 ∶5 000)，于4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入相應(yīng)二抗中室溫孵育1 h，再次洗膜，ECL顯影、曝光成像。分析丁卡因干預(yù)后細(xì)胞中相應(yīng)蛋白變化(Image J軟件)。

1.2.5 動物實驗 取12只雄性BALB/C小鼠(成都達(dá)碩，6-8周齡，體質(zhì)量21-26 g)隨機分為對照組(n=6)和丁卡因組(n=6)，均于小鼠右側(cè)背部皮下注入B16細(xì)胞0.1 ml(約5×106個)，待小鼠背部成瘤后，丁卡因組經(jīng)腹腔注射丁卡因干預(yù)(20 mg/kg)，對照組經(jīng)腹腔予等體積生理鹽水作為對照，隔天給藥，1周后取下腫瘤組織，觀察腫瘤組織大小并稱重記錄。

1.2.6 免疫組化法檢測腫瘤組織中Survivin的蛋白表達(dá)水平 將腫瘤組織于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)蔗糖梯度脫水，石蠟包埋后切片，依次進(jìn)行：脫蠟；水化；抗原修復(fù)；血清封閉孵育；滴加Survivin抗體；孵相應(yīng)二抗；顯色劑顯色；復(fù)染后梯度脫水；二甲苯透明；中性樹膠封片。觀察并拍照后分析Survivin表達(dá)變化(Image J)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩組間比較采用獨立t檢驗，多組采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丁卡因抑制黑色素瘤細(xì)胞活力

丁卡因顯著抑制了黑色素瘤細(xì)胞A375和B16的細(xì)胞活力，呈濃度依賴性(見圖1)。與空白對照相比，0.3，0.4，0.5，0.6 mmol/L丁卡因干預(yù)24 h，A375細(xì)胞活力分別被抑制24%，48%，81%，93%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，半數(shù)抑制率(IC50)約為0.41 mmol/L。0.1，0.15，0.2，0.3 mmol/L丁卡因處理24 h，B16細(xì)胞活力分別被抑制14%，51%，62%，92%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，B16細(xì)胞半數(shù)抑制率(IC50)為0.16 mmol/L。丁卡因?qū)τ贐16細(xì)胞的IC50低于對A375細(xì)胞的IC50，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

2.2 丁卡因抑制黑色素瘤細(xì)胞集落形成

集落實驗結(jié)果顯示，0.05，0.10，0.15 mmol/L丁卡因分別干預(yù)黑色素瘤細(xì)胞A375和B16后，與對照組(0 mmol/L)相比，丁卡因組集落數(shù)量隨丁卡因濃度增加逐漸減少(P<0.001，見圖2)。

與對照(100%)相比，* * * P <0.001圖1 丁卡因?qū)谏亓黾?xì)胞活力的影響Figure 1 Effect of tetracaine on cell viability of melanoma

與對照組(0 mmol/L)相比，* * * P <0.001圖2 丁卡因?qū)谏亓黾?xì)胞集落形成的影響Figure 2 Effect of tetracaine on colony formation of melanoma

2.3 丁卡因下調(diào)Survivin和MDM2蛋白的表達(dá)

本實驗檢測了丁卡因干預(yù)后黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)Survivin蛋白及其上游蛋白MDM2的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，在A375及B16細(xì)胞中，丁卡因干預(yù)后MDM2蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.001)；同時Survivin蛋白的表達(dá)也明顯減少(P<0.001，見圖3)。

2.4 丁卡因抑制小鼠皮下黑色素瘤的生長

實驗過程中未觀察到小鼠出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)。實驗結(jié)束時對照組取得6個明顯瘤體；丁卡因組取得4個明顯瘤體，另外兩只小鼠解剖皮下后僅可見黑斑殘余(質(zhì)量記為0 g)。與對照組相比，腹腔注射丁卡因可明顯抑制小鼠皮下黑色素瘤的生長，其瘤體質(zhì)量明顯降低(P<0.05，見圖4)。

與對照組相比，* * * P <0.001圖3 丁卡因?qū)谏亓鲋蠱DM2和Survivin蛋白表達(dá)影響Figure 3 Effect of tetracaine on the expression of MDM2 and Survivin proteins in melanoma

圖4 丁卡因?qū)π∈笃は潞谏亓龅挠绊慒igure 4 Effect of tetracaine on the growth of subcutaneous melanoma in mice

2.5 丁卡因使黑色素瘤組織中Survivin蛋白的表達(dá)下降

相比于對照組，丁卡因組黑色素瘤組織中Survivin蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.001，見圖5)，提示丁卡因下調(diào)了黑色素瘤組織中Survivin蛋白的表達(dá)。

圖5 丁卡因下調(diào)黑色素瘤組織中的Survivin (DAB染色)Figure 5 Tetracaine down-regulates the level of Survivin in melanoma tissue (DAB staining)

3 討論

雖然局麻藥經(jīng)常用于腫瘤患者的外科手術(shù)及癌痛的控制，但局麻藥在腫瘤生物學(xué)中的意義尚不清楚[5]。臨床證據(jù)表明局部麻醉能夠影響腫瘤術(shù)后轉(zhuǎn)移的病理生理過程并減少腫瘤的復(fù)發(fā)，包括乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌以及黑色素瘤[5,6,10-12]。然而是局麻藥本身的作用還是麻醉技術(shù)的影響抑或是它們的聯(lián)合作用抑制了腫瘤的進(jìn)展需要進(jìn)一步探索。在本研究中，我們采用黑色素瘤模型探究了酯類局麻藥丁卡因的抗腫瘤作用。此外，我們還建立了小鼠皮下黑色素瘤模型，研究了丁卡因在活體上的抗腫瘤作用。丁卡因在細(xì)胞及動物水平上都能明顯抑制黑色素瘤，這為丁卡因在腫瘤手術(shù)及術(shù)后鎮(zhèn)痛、癌痛鎮(zhèn)痛等方面提供了潛在應(yīng)用價值。

我們首先通過A375和B16兩種黑色素瘤細(xì)胞系研究了丁卡因?qū)δ[瘤的作用。A375是人來源的黑色素瘤，B16是鼠來源的黑色素瘤。A375和B16在黏附蛋白、營養(yǎng)因子的產(chǎn)生和基因圖譜等重要方面有差異，具有不同的遺傳特點，是研究黑色素瘤的常用細(xì)胞系[13]。結(jié)果顯示，丁卡因以濃度依賴的方式抑制黑色素瘤A375和B16細(xì)胞活力，IC50分別為0.41 mmol/L和0.16 mmol/L。值得注意的是，丁卡因?qū)16細(xì)胞的IC50明顯低于A375細(xì)胞的IC50(P<0.001)，具有較高增殖能力的B16對丁卡因的反應(yīng)更加敏感。此前Gregoire等[14]也發(fā)現(xiàn)羅哌卡因?qū)uH7和人肝癌祖細(xì)胞的影響比對分化的人肝癌細(xì)胞影響更明顯。這可能是因為局麻藥對高增殖能力的細(xì)胞比低增殖能力細(xì)胞的作用更強。從機制上來說，局麻藥可能通過靶向某些促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖能力的信號通路或離子通道或受體發(fā)揮作用。

單個細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體，稱為集落或克隆。細(xì)胞集落形成實驗可以反應(yīng)細(xì)胞的增殖能力。在我們的研究中，丁卡因以濃度依賴的方式抑制A375和B16的集落形成。我們發(fā)現(xiàn)0.05 mmol/L丁卡因能夠抑制A375和B16的集落形成能力，但此濃度的丁卡因?qū)τ贏375和B16的細(xì)胞活力基本沒有明顯影響，這和此前報道的羅哌卡因在較低濃度時就表現(xiàn)出抑制腫瘤細(xì)胞增殖，但沒有細(xì)胞毒性作用相一致[15,16]。因此，不同濃度的丁卡因?qū)谏亓鼍哂胁煌囊种谱饔茫谳^低濃度主要表現(xiàn)為增殖抑制作用，在較高濃度則表現(xiàn)為直接的細(xì)胞毒性作用。

為進(jìn)一步研究丁卡因在活體上對黑色素瘤的抑制作用，我們建立了小鼠皮下黑色素瘤模型，并通過腹腔注射丁卡因治療小鼠。結(jié)果顯示，丁卡因明顯抑制了小鼠皮下黑色素瘤的生長。但其對免疫的影響不清楚，其是否可以通過增強T細(xì)胞對腫瘤的殺傷作用也未知。實驗期間未觀察到小鼠出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，腹腔注射丁卡因(20 mg/kg)對于BALB/c小鼠是一種可行的治療方式。綜上，丁卡因可能是一種有前景的抗黑色素瘤藥物。但目前關(guān)于其機制和臨床應(yīng)用的研究有限，對于其機制和臨床應(yīng)用的研究探索將有利于癌癥手術(shù)患者的預(yù)后。

Survivin，細(xì)胞凋亡抑制家族(IAPs)成員，是IAPs家族中抗凋亡能力最強的蛋白之一。Survivin在腫瘤中呈高表達(dá)且可以抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、增殖及對化療的耐藥性[17]。Survivin的高表達(dá)是侵襲性和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的共有特征，在黑色素瘤細(xì)胞系中使用反義或顯性陰性突變體就足以引起細(xì)胞凋亡[18]。在本研究中，我們先發(fā)現(xiàn)了丁卡因使得黑色素瘤細(xì)胞A375和B16中Survivin的表達(dá)下調(diào)，追溯Survivin的上游蛋白MDM2發(fā)現(xiàn)其表達(dá)也下降，丁卡因可能是通過MDM2-Survivin通路介導(dǎo)黑色素瘤的死亡的。此外我們在小鼠皮下腫瘤模型得到了一致的結(jié)果：丁卡因抑制小鼠皮下黑色瘤的生長，丁卡因組瘤體組織Survivin蛋白表達(dá)減少。這說明，丁卡因發(fā)揮抗黑色素瘤的作用可能是通過MDM2下調(diào)Survivin表達(dá)實現(xiàn)的。

綜上所述，丁卡因在細(xì)胞水平及活體動物上都顯現(xiàn)出強有力的抗黑色素瘤(A375和B16)作用，這可能與其通過MDM2下調(diào)Survivin的表達(dá)相關(guān)。