那如三味丸治療類風濕關節炎的網絡藥理分析*

白靜茹，白 力，張文蘭

(1.內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院風濕免疫科，內蒙古 包頭 014010；2.包頭醫學院風濕免疫研究所；3.內蒙古自體免疫學重點實驗室)

RA是一種慢性自身免疫性疾病，以侵蝕性、對稱性多關節炎為主要臨床表現，導致關節軟骨和骨破壞，最終發展成關節畸形和功能喪失，嚴重影響患者生活質量[1]。蒙醫中RA屬于托列病的范疇。近期多種研究發現蒙藥具有治愈率高、不易復發、副作用小等特點，因此蒙藥用于防治RA具有良好的發展前景。

那如三味丸，又稱那如蘇木珠爾，由訶子，蓽撥，制草烏組成，具有祛風，止痛，散寒作用，可用于治療風濕、關節疼痛、白喉等癥，是蒙醫臨床常用蒙藥之一。有研究發現，在佐劑性關節炎(Adjuvant arthritis, AA)動物模型中，那如三味丸有明顯的治療作用，能夠減輕大鼠足腫脹程度并降低炎性因子水平[2]。此外，在臨床研究中，使用那如三味丸治療RA能夠緩解關節破壞，延緩疾病進展，且無明顯藥物不良反應[3]。其治療RA療效雖然明確，但是其靶點及作用機制尚有待探究。

網絡藥理學于2007年被提出，是建立在高通量組學數據分析、虛擬計算及網絡數據庫檢索基礎上，基于藥物、成分、靶點之間的關聯性，通過生物信息網絡構建及網絡拓撲結構分析，構建“藥物-成分-靶點”網絡；基于藥物與藥物之間的相同成分、功效和內在結構，構建“藥物-藥物”網絡，探索藥物有效成分的具體作用靶點和藥物功效。綜上，本次研究應用網絡藥理學方法全面解析那如三味丸治療RA的機制，為后期生物學驗證提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1那如三味丸活性成分信息及作用靶點的獲取 從TCMSP數據庫[4]獲得那如三味丸的化合物信息，并以“經口服生物利用度”(OB)≥30%、“類藥性指數”(DL)≥0.18為條件篩選化合物，將篩選出的藥物活性成分以Smile ID格式輸入到SwissTarget Prediction數據庫[5]，預測化合物的作用靶點，選取基因疾病多效性指數(Disease pleiotropy index for the gene, DPI)大于0.75的靶點，保留靶點Uniprot ID、名稱等信息。

1.2RA靶點的獲取 在DisGeNET數據庫[6]中輸入“Rheumatoid arthritis”，獲取RA相關靶點，將上述獲得的化合物作用靶點與RA靶點進行匹配，篩選出共同靶點，得到那如三味丸治療RA的潛在靶點。

1.3蛋白-蛋白相互作用網絡構建分析 將潛在靶點信息導入到String數據庫[7]，獲得靶點間的蛋白-蛋白相互作用(Protein-protein interaction, PPI)網絡關系，導出圖片。

1.4網絡分析及Hub節點選擇 將潛在靶點的Uniprot ID導入到Cytoscape軟件的GO插件中，種屬設置為“Homo sapiens”，設置P≤0.05，選擇Molecular Function、Biological Process、Immune System Process分析及KEGG分析，應用氣泡圖和Cytoscape進行可視化處理。應用CytoHubba插件在靶點通路圖中篩選關鍵靶點及通路。

2 結果

2.1那如三味丸治療RA的潛在靶點 根據TCMSP數據庫收錄情況，結合OB及DL篩選，找到那如三味丸化學成分29個，應用化合物分子結構在SwissTarget Prediction數據庫預測靶點，并與DisGeNET數據庫獲得的RA靶點進行匹配，獲得那如三味丸治療RA的潛在靶點106個，根據DPI排序。見表1。

表1 那如三味丸治療RA的潛在靶點

55CYP2C19P33261cytochrome P450 family 2 subfamily C member 190.85756PPARGP37231peroxisome proliferator activated receptor gamma0.85757MAPK1P28482mitogen-activated protein kinase 10.85758CYP2C9P11712cytochrome P450 family 2 subfamily C member 90.85759JUNP05412Jun proto-oncogene, AP-1 transcription factor subunit0.85760BCL2L1Q07817BCL2 like 10.85761TERTO14746telomerase reverse transcriptase0.85762HPRT1P00492hypoxanthine phosphoribosyltransferase 10.85763PLATP00750plasminogen activator, tissue type0.85764HPGDSO60760hematopoietic prostaglandin D synthase0.85765FGF2P09038fibroblast growth factor 20.85766SIRT1Q96EB6sirtuin 10.85767CASP8Q14790caspase 80.85768MCL1Q07820BCL2 family apoptosis regulator0.85769MAPK3P27361mitogen-activated protein kinase 30.85770BRAFP15056B-Raf proto-oncogene, serine/threonine kinase0.85771CCR2P41597C-C motif chemokine receptor 20.85772CFTRP13569cystic fibrosis transmembrane conductance regulator0.85773DNMT1P26358DNA methyltransferase 10.85774APPP05067amyloid beta precursor protein0.85775SHHQ15465sonic hedgehog0.85776PPARAQ07869peroxisome proliferator activated receptor alpha0.85777PTPN22Q9Y2R2protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 220.82178ALOX5P09917arachidonate 5-lipoxygenase0.82179DHFRP00374dihydrofolate reductase0.82180STSP08842steroid sulfatase0.82181TYMSP04818thymidylate synthetase0.82182MMP1P03956matrix metallopeptidase 10.82183VCAM1P19320vascular cell adhesion molecule 10.82184NR3C1P04150nuclear receptor subfamily 3 group C member 10.82185SELEP16581selectin E0.82186NFKBIAP25963NFKB inhibitor alpha0.82187ESR2Q92731estrogen receptor 20.82188PTGS1P23219prostaglandin-endoperoxide synthase 10.82189CCR3P51677C-C motif chemokine receptor 30.82190CYP19A1P11511cytochrome P450 family 19 subfamily A member 10.82191PGRP06401progesterone receptor0.82192GSTK1Q9Y2Q3glutathione S-transferase kappa 10.82193PLGP00747plasminogen0.82194NR1I2O75469nuclear receptor subfamily 1 group I member 20.82195FLT1P17948fms related tyrosine kinase 10.82196EDNRAP25101endothelin receptor type A0.82197PTPN11Q06124protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 110.82198CASP1P29466caspase 10.82199GSTM2P28161glutathione S-transferase mu 20.821100RAF1P04049Raf-1 proto-oncogene, serine/threonine kinase0.821101EDNRBP24530endothelin receptor type B0.821102ELANEP08246elastase, neutrophil expressed0.821103EZH2Q15910enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit0.821104FGFR1P11362fibroblast growth factor receptor 10.821105MAP2K1Q02750mitogen-activated protein kinase kinase 10.821106CDC42P60953cell division cycle 420.821

2.2靶點PPI網絡 將106個交集靶點導入String數據庫中，設置種屬為人類，獲得PPI網絡。圖中MAPK1、MAPK3、信號傳導及轉錄激活蛋白-3(Signal transducer and activator of transcription-3, STAT-3)、表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor, EGFR)在網絡中自由度較高。見圖1。

2.3網絡分析 將106個靶點的Uniprot ID導入Cytoscape的GO插件中，進行Molecular Function、Biological Process、Immune System Process分析，獲得靶點相關功能。應用氣泡圖對靶點參與的功能及生物過程進行可視化處理并對靶點基因參與的免疫過程進行分析。見圖2，圖3，表2。

圖1 那如三味丸治療RA的PPI網絡圖

圖2 那如三味丸靶點基因的主要功能

圖3 那如三味丸靶點基因參與的生物過程

2.4信號通路分析及Hub節點選擇 將靶點導入KEGG數據庫，獲得靶點參與信號通路信息，應用Cytoscape建立靶點-信號通路圖；應用CytoHubba插件對網絡圖進行分析，篩選得到Hub節點，排名前3的信號通路為PI3K-Akt信號通路、趨化因子信號通路、HIF-1信號通路，關鍵靶點為MAPK1和MAPK3。見圖4，圖5。

表2 那如三味丸靶點基因參與的免疫過程

圖4 那如三味丸靶點-信號通路圖

圖5 那如三味丸治療RA的關鍵靶點及通路

3 討論

RA是由T細胞、B細胞、中性粒細胞等進入關節腔誘導的持續炎癥[8-9]。由于其發病機制復雜，常用的藥物以單一靶點治療RA療效欠佳，而蒙藥具有多途徑、多靶點治療RA的作用特點，可發揮較好的治療效果。本研究首先通過數據庫預測到那如三味丸治療RA的106個靶點，并通過String數據庫構建PPI網絡圖，獲得靶點間相互作用關系。在106個靶點中，MAPK1、MAPK3、STAT3、EGFR、AKT1與多種蛋白存在緊密聯系，且炎癥相關靶點Toll樣受體-4(Toll-like receptor 4, TLR-4)、前列腺素內過氧化物合酶-2(Prostaglandin-endoperoxide synthase 2, PTGS2)、核因子κB1(Nuclear factor kappa-B1, NF-κB1)在網絡中自由度較高[10-12]。前期研究發現那如三味丸可通過miR-250a/P65途徑發揮抗炎作用[13]，與本研究預測靶點相同，證明了結果的可靠性；應用GO分析，發現那如三味丸治療RA的靶點通過調節細胞因子結合、G蛋白偶聯肽受體活性、PI3K活性等功能發揮治療作用；靶點通過參與細胞因子介導的信號通路、炎癥反應的調節、調節免疫應答中涉及的細胞因子產生等29種生物過程及白細胞分化、巨噬細胞分化等6種免疫過程來影響RA的進展；應用KEGG通路分析，發現靶點參與PI3K-AKT信號通路、趨化因子信號通路、HIF-1信號通路等與RA密切相關的信號通路22條，最終確定的關鍵靶點及通路包括：MAPK1、MAPK3、PI3K-Akt信號通路、趨化因子信號通路及HIF-1信號通路。

關鍵靶點中MAPK1/ERK2和MAPK3/ERK1是ERK信號通路的關鍵蛋白，ERK信號通路為MAPK經典信號通路，通過磷酸化激活的級聯反應對炎癥起到調控作用。以往研究發現，ERK信號通路可介導RA滑膜成纖維細胞增殖，參與RA進展[14]；中藥復方二妙散可抑制ERK信號通路靶向治療RA[15]，與此相同。本研究預測那如三味丸可通過MAPK1、MAPK3抑制ERK信號通路，從而抑制RA滑膜成纖維細胞增殖。

關鍵通路中，PI3K-Akt信號通路與RA多種病理過程密切相關，由于該通路可作用多種不同的底物，決定了PI3K-Akt信號通路功能的多樣性。研究發現通路在RA中以NF-κB為底物可增加抑瘤素M(Oncostatin M, OSM)的表達，OSM可誘導炎癥反應并影響成骨細胞功能[16]；Tian等[17]研究發現，白藜蘆醇可通過抑制PI3K-Akt信號通路降低腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α, TNFα)誘導的白介素1-β(Interleukin 1-β, IL-1β)及基質金屬蛋白酶3(Matrix metalloproteinase 3, MMP3)的表達。本研究結果預測那如三味丸可能靶向PI3K-Akt信號通路發揮治療意義。趨化因子信號通路是與RA密切相關的信號通路，RA發生后滑膜組織大量表達趨化因子，趨化淋巴細胞和單核細胞/巨噬細胞的遷移，誘導持續的炎癥發生，因此以趨化因子信號通路為靶點，可減輕滑膜組織的炎癥反應。關鍵信號通路HIF-1在RA的血管翳形成中發揮重要作用，RA關節腔內存在缺氧情況[18]，缺氧誘導的HIF-1信號通路可促進血管翳形成，最終導致關節病變及軟骨破壞，因此那如三味丸可能通過HIF-1信號通路減少血管翳的形成，延緩疾病的進展。

本研究通過網絡藥理學方法全面分析了蒙藥那如三味丸治療RA的作用機制，通過分析發現那如三味丸可通過MAPK1、MAPK3、EGFR、AKT、STAT3等靶點，發揮抗炎、減少血管翳形成等作用，干預RA的發生發展，研究結果為臨床用藥提供了更多理論支持，同時為后續的基礎研究提供了可靠靶點。