LY2109761對HSC-T6細胞生存及凋亡的影響*

余家莉，張帥，周石,2**

(1.貴州醫(yī)科大學 醫(yī)學影像學院，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 介入科，貴州 貴陽 550004)

在所有類型的癌癥中，肝癌的發(fā)病率和死亡率均位居全球前五位，已成為全球第五大最常見的惡性腫瘤[1-2]。肝癌發(fā)病機制十分復雜，早期缺乏典型的臨床癥狀，往往在確診時已進入中晚期，治療難度大，預后差[3]，可見早期診斷和治療對提高肝癌患者的預后和生存率至關重要。肝纖維化是指不同病因引起的肝組織重復損傷導致肝臟再生能力受損的過程[4-5]，持續(xù)肝纖維化將可肝癌，有效的控制和逆轉肝纖維化可降低肝癌發(fā)病率和致死率[6]。轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)/Smad信號通路對纖維化的形成及進展具有重要作用[7-9]。LY2109761是一種新型的TGF-β選擇性抑制劑，可以抑制TGF-β受體Ⅰ(TGF-β receptor type Ⅰ，TβR Ⅰ)和TGF-β受體Ⅱ(TGF-β receptor type Ⅱ，TβR Ⅱ)的結合[10]。有研究報道，LY2109761對放射性肺纖維化具有治療作用[11]，但未見其對肝纖維化防治作用的相關報道。因此，本研究利用大鼠肝星狀細胞株HSC-T6細胞，觀察LY2109761對HSC-T6細胞生存和凋亡的影響，探究其抗肝纖維化作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞 大鼠肝星狀細胞系HSC-T6(吉尼歐，中國)。

1.1.2藥品與試劑 LY2109761(美國MedChemExpress公司)，秋水仙堿(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，0.25%胰蛋白酶、胎牛血清及DMEM高糖培養(yǎng)基為美國gibco公司產(chǎn)品，Cell Counting Kit-8(CCK-8)、ECL plus超敏發(fā)光液、高效RIPA組織細胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、一抗稀釋液及Western快速封閉液由中國上海碧云天生物科技有限公司提供，α-SMA抗體及Collagen Ⅰ抗體為中國上海愛必信生物科技有限公司產(chǎn)品，TGF-β1抗體、Smad2抗體及p-Smad2抗體為美國Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品，β-actin抗體(美國abcam公司)，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(美國Sigma公司)。

1.1.3儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo scientific公司)，Thermo fresco 17低溫高速離心機及arioskan LUX多功能酶標儀為美國Thermo公司產(chǎn)品，高壓蒸汽滅菌鍋(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療儀器廠)，HDL雙人超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)，液氮生物容器(成都金鳳液氮容器有限公司)，超純水機(四川沃特爾科技發(fā)展有限公司)，TS-100F熒光倒置顯微鏡及CCD照相系統(tǒng)(日本Nikon公司)，電泳儀(美國BIO-Rad公司)、FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1HSC-T6細胞的培養(yǎng) HSC-T6細胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待貼壁生長達80%融合時，用0.25%胰酶消化并傳代。

1.2.2CCK-8法檢測HSC-T6細胞存活率 取對數(shù)生長期的HSC-T6細胞，以3×104個/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后設立空白組、LY2109761給藥組和陽性組，空白組始終在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，陽性組加入含25 μmol/L秋水仙堿的完全培養(yǎng)基，LY2109761給藥組加入含10、20、30、40、50、60、70 μmol/L LY2109761的完全培養(yǎng)基；分別在給藥12、24、36 h加入10 μL CCK-8，避光孵育3 h后、在酶標儀450 nm波長處測定吸光度(A)值。根據(jù)吸光度計算細胞存活率，細胞存活率(%)=(A給藥組/A空白組)×100%。

1.2.3細胞劃痕法檢測HSC-T6細胞遷移能力 將對數(shù)生長期的HSC-T6細胞以3×104個/mL接種于6孔板，每孔2 mL，用標記筆在6孔板外間隔0.5 cm畫多條橫行直線，當細胞貼壁生長密度達80%時，在板內(nèi)劃多條垂直于標記筆橫線的豎行劃痕甬道，棄去上清，用PBS潤洗1次。細胞分為空白組、LY2109761給藥組和陽性組，空白組始終在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，LY2109761給藥組加入含LY2109761濃度為53 μmol/L完全培養(yǎng)基，陽性組加入含秋水仙堿25 μmol/L的完全培養(yǎng)基。拍照觀察0 h及24 h時多個標記點處的劃痕甬道變化情況。

1.2.4流式細胞儀檢測HSC-T6細胞凋亡率 將對數(shù)生長期的HSC-T6細胞以3×104個/mL接種于100 mm細胞培養(yǎng)皿中，10 mL/皿。設立空白組、LY2109761給藥組和陽性組，空白組始終在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，LY2109761給藥組加入濃度為53 μmol/L LY2109761的完全培養(yǎng)基，陽性組加入含25 μmol/L秋水仙堿的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后吸棄上清液，用5 mL預冷的PBS緩沖液洗2次，加入不含EDTA的胰酶1 mL消化120 s，再加入5 mL培養(yǎng)基重懸細胞，按照Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒說明書標記細胞，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5蛋白提取 按1.2.3項下方法鋪板給藥處理細胞，用預冷的PBS洗3次，在冰上使用RIPA裂解液裂解細胞，待細胞為黏稠狀時將其轉移至離心管中，冰上裂解30 min，每10 min渦混1次，使細胞與裂解液充分接觸，在4 ℃情況下12 000 r/min離心10 min，取上清液即為總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，加入蛋白將5 × 上樣緩沖液稀釋為1 ×，沸水浴變性10 min，冷卻至室溫備用。

1.2.6Western blot法檢測細胞內(nèi)α-SMA、Collagen Ⅰ、TGF-β1和p-Smad2蛋白表達 取等量總蛋白上樣，使用SDS-PAGE電泳分離后，電轉移至PVDF膜，用5% BSA溶液4 ℃封閉3 h，加入相應一抗，4 ℃過夜；TBST洗滌5次、5 min/次，加入二抗，室溫孵育2 h。TBST洗滌5次、5 min/次，取適量ECL plus發(fā)光液，均勻滴加在PVDF膜上，避光靜止孵育1 min，放入凝膠成像儀顯影曝光，拍照保存。實驗結果用Quantity one凝膠圖像分析系統(tǒng)分析，測定目的蛋白和內(nèi)參蛋白的灰度值，β-actin為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 LY2109761對HSC-T6細胞存活率的影響

與空白組比較，不同濃度的LY2109761作用HSC-T6細胞12、24和36 h后，細胞存活率均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。根據(jù)各組平均A值計算出給藥24 h時的半抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)為53.72 μmol/L，故后續(xù)選擇53 μmol/L LY2109761為給藥濃度。

表1 不同濃度LY2109761及不同作用時間對HSC-T6細胞存活率的影響

2.2 LY2109761對HSC-T6細胞遷移的影響

細胞劃痕檢測結果如圖1所示，與空白組比較，LY2109761和秋水仙堿作用24 h后，HSC-T6細胞的遷移均被明顯抑制，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

注：A為細胞劃痕試驗結果，B為細胞劃痕寬度數(shù)值結果；(1)與空白組24 h時比較，P<0.01。

2.3 LY2109761對HSC-T6細胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI雙染技術常用于細胞凋亡的檢測，結果分為Q1-Q4共4個區(qū)域，其中Q1區(qū)代表機械損傷細胞和少量晚凋細胞，Q2區(qū)代表晚凋細胞，Q3區(qū)代表活細胞，Q4區(qū)代表早凋細胞。結果如圖2所示，空白組有少量損傷和凋亡細胞，細胞凋亡率為(3.0±0.1)%。與空白組比較，LY2109761給藥組和陽性組的凋亡細胞明顯增加，細胞凋亡率分別為(41.4±3.1)%和(37.1±2.8)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

注：A為流式細胞術試驗結果，B為細胞凋亡率數(shù)值結果；(1)與空白組比較，P <0.001。

2.4 LY2109761對HSC-T6細胞α-SMA、Collagen Ⅰ、TGF-β1和p-Smad2蛋白表達的影響

Western blot檢測結果如圖3所示，與空白組比較，LY2109761給藥組和陽性組細胞的α-SMA、Collagen Ⅰ、TGF-β1和p-Smad2蛋白表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。提示LY2109761抑制HSC-T6細胞的增殖活化作用與TGF-β1/Smad通路有關。

注：A為蛋白印跡試驗結果，B為蛋白相對表達的定量結果；(1)與空白組同指標比較，P<0.01。

3 討論

肝纖維化是多種慢性肝病早期可逆的動態(tài)病理過程，若不及時治療，將會演變?yōu)楦斡不M而導致肝癌[12]。在我國，約有4/5的原發(fā)性肝癌由肝硬化發(fā)展而來，如何阻止或逆轉肝纖維化的發(fā)展已成為近幾年肝病的研究熱點[13-14]。細胞外基質增多是導致肝纖維化的主要原因[15]，而肝星狀細胞(hepatic stellated cell，HSC)是合成細胞外基質的關鍵細胞，干擾HSC的活化可阻止或逆轉肝纖維化的進程[16-18]。本研究利用LY2109761作用HSC-T6細胞，發(fā)現(xiàn)LY2109761能明顯抑制HSC-T6細胞的存活和遷移能力，并促進細胞凋亡，其作用程度與秋水仙堿相當。TGF-β/Smad通路與肝纖維化的調(diào)控緊密相關，TGF-β1是目前認為最重要的致肝纖維化因子[19-20]，Samd信號蛋白是TGF-β的下游轉導蛋白，能將TGF-β家族信號從相關細胞膜受體傳遞到相應細胞核[21]。在正常肝組織中TGF-β1含量較低，但當肝損傷時，HSC中的TGF-β1表達升高，激活下游蛋白Smad2，使HSC活化標志蛋白α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達增加，并分泌出Collagen Ⅰ，進而促進肝纖維化[22-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，LY2109761和秋水仙堿均能降低α-SMA、Collagen Ⅰ、TGF-β1和p-Smad2蛋白表達水平，且作用程度相當。

綜上所述，LY2109761可能是通過降低TGF-β1和p-Smad2的蛋白表達水平，抑制TGF-β1/Smad通路的激活，從而抑制α-SMA和Collagen Ⅰ的蛋白表達，并抑制HSC-T6細胞的生存、遷移、凋亡和活化，進而產(chǎn)生抗肝纖維化作用，且作用程度與秋水仙堿相當。