過表達Seipin對大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞凋亡的影響*

胡玉梅，任真奎,3，郭冬芬，劉穎，吳昌學 **，禹文峰 **

(1.貴州醫科大學 分子生物學重點實驗室, 貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫科大學 地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室, 貴州 貴陽 550004; 3.黔西南州人民醫院 檢驗科, 貴州 興義 562400)

Seipin(berardinelli-seip congenital lipodystrophy type 2,BSCL2/Seipin)是由人類先天性全身性脂肪營養不良Ⅱ型基因編碼的非酶蛋白，于1954年首次被發現[1]，定位于內質網內的非酶蛋白，高表達于大腦，睪丸及全身脂肪細胞，在調節脂滴的形成、脂肪生成、脂滴穩態以及細胞甘油三酯脂解過程中都起重要作用[2-4]。在腎相關疾病研究中發現，Seipin缺失時會發生腎脂質積聚和出現蛋白尿、產生胰島素抵抗、并調節睪丸磷脂穩態[5]。研究發現，BSCL2/Seipin在阿爾茨海默病、帕金森(parkinson disease，PD)、腦卒中等疾病中都有重要作用[6-8]，Seipin在PD患者中表達降低[9-10]；在敲除神經細胞Seipin的小鼠中，小鼠神經元增殖能力減弱、運動協調方面表現出年齡相關的缺陷，進一步引起α-突觸核蛋白的聚集磷酸化等現象[11-12]。有研究發現Seipin在中樞神經系統中高度表達、運動相關神經核內亦存在Seipin 陽性神經元，推測Seipin可能對PD的形成或發展有重要作用[13]。在PD細胞實驗過程中，常用大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(Pheochromocytoma , PC12)構建PD細胞模型[14-15]，本研究通過構建Seipin高表達PC12細胞，觀察Seipin對PC12細胞凋亡的影響，并為下一步對PD病研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞及儀器 PC12細胞(購于中國上海生命科學院細胞庫)，BG-power600電泳儀(BAYGENE)、CSU-W1激光共聚焦顯微鏡(YOKOGAWA)、1730R冷凍高速離心機(GENESPEED)、ECO實時熒光定量PCR儀(廣東儀濤科學儀器有限公司)。

1.1.2實驗試劑 DMEM培養基(美國gibco公司)、胎牛血清(美國gibco公司)、過表達慢病毒pHS-AVC-LW1760(北京合生基因科技有限公司)、陰性對照慢病毒pHS-BVC-LW346(北京合生基因科技有限公司)、逆轉錄試劑盒(TAKARA)、FastStart Universal SYBR Green Master(ROX，羅氏)、SDS快速凝膠試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)、一抗二抗稀釋液(上海碧云天生物技術有限公司)、Seipin(美國Abcom)、Bax(absin)、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(YEASEN)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 將PC12細胞用PBS清洗3次、加入0.25%胰酶0.5 mL消化細胞，1 min后加入2 mL完全培養基(含1%的雙抗和10%胎牛血清的DMEM)終止消化；將培養基吸取吹打培養瓶底部使細胞完全脫落，吸取細胞懸液入新的15 mL離心管，1 000 r/min離心5 min；棄上清，2 mL完全培養基重懸細胞，加入培養瓶中37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1.2.2構建Seipin過表達PC12細胞 將PC12細胞以3.0×104個每孔種入12孔板中，分為正常PC12細胞組(正常組)、陰性對照病毒pHS-BVC-LW346感染組(陰性組)和pHS-AVC-LW1760感染組(Seipin過表達組)，加入對應的慢病毒，同時加入助感染試劑，培養24 h熒光拍照，并將培養液換為含有10%FBS的DMEM培養基繼續培養，轉染慢病毒質粒帶有紅色熒光和嘌呤霉素抗性篩選基因：細胞密度適當時候換為加含有嘌呤霉素的培養基篩選具有抗性的細胞。

1.2.3Real time PCR檢測BSCL2 mRNA表達水平 取出處理好的細胞，PBS洗3遍，采用TRIZOL一步法提取RNA，TAKARA逆轉錄試劑盒將RNA逆轉為cDNA，作為Real time PCR模板進行下一步或-80 ℃保存。每個樣品取1個200 μL的薄壁管，加入SYBR Green 5 μL、雙蒸水3 μL、上下游引物0.5 μL、模板cDNA 1 μL配制成1 0μL體系，加入PCR板，上機檢測。

1.2.4Western blot檢測凋亡相關蛋白BCL2-Associate X蛋白(Bax)的表達 取出分組處理好的細胞，棄培養液，用4 ℃預冷PBS洗3次。加入適量細胞裂解液，將裂解的細胞懸液轉入1.5 mL Epp管，置于冰上裂解30 min，該期間每5 min劇烈振蕩15～30 s，12 000 r/min 4 ℃離心10 min。馬上將上清吸取至預冷的EPP管中。配制標準品，將樣品進行蛋白定量，根據蛋白定量結果，SDS蛋白上樣緩沖液混合沸水浴10 min，上樣電泳，30 mA SDS-PAGE凝膠電泳，冰浴轉膜、240 mA恒流2 h。轉膜結束后取出PVDF膜，TBST漂洗3次，封閉1 h后TBST漂洗3次，一抗4 ℃孵育過夜、TBST漂洗3次，二抗室溫孵育2 h，TBST漂洗3次進行化學發光曝光儀曝光，曝光得到圖片用Image J計算目的蛋白和相應內參的灰度值進行統計分析。

1.2.5TUNEL試劑盒染色檢測細胞內斷裂DNA情況 向12孔中板內放入20 mm的細胞爬片，將1.0×105個細胞種入12孔板內，培養24 h、棄培養液，4%多聚甲醛室溫固定細胞20 min。PBS洗2遍每次5 min，加入0.5%的Triton-100通透，孵育20 min，PBS洗2遍每次5 min。陽性對照做預先處理：加入1×DNase I Buffer 100 μL，孵育5 min后加入每100 μL含有1 U DNA酶I的1×DNase I Buffer 100 μL、孵育10 min，去離子水洗3遍。所有樣本滴加1×Equilibration Buffer 100 μL，室溫下孵育20 min。配制TdT孵育緩沖液，即 ddH2O 34 μL、5×Equilibration Buffer 10 μL、Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix 5 μL、TdT(陰性對照換為雙蒸水)1 μL，將爬片上 1×Equilibration Buffer吸水紙吸除，加入TdT孵育緩沖液50 μL，放入濕盒37 ℃避光孵育1 h。取出PBS洗2遍，加入DAPI封片，Confocal拍照。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 熒光鑒定

通過慢病毒感染PC12細胞，慢病毒質粒帶有RFP熒光，細胞感染24 h后便可觀察是否出現紅色熒光，初步鑒定感染是否成功，圖1顯示：正常組未加慢病毒感染，不能觀察到紅色熒光，慢病毒載體感染的細胞陰性組、過表達組均出現紅色熒光，感染效率在80%以上。

圖1 慢病毒感染后熒光結果(標尺200 μm)

2.2 BSCL2 mRNA表達

通過提取正常組PC12細胞、感染后經嘌呤霉素篩選后的陰性組和Seipin過表達組細胞mRNA做定量分析，Seipin過表達組BSCL2 mRNA水平相較正常組和陰性組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：(1)與正常組和陰性組比較，P<0.01。

2.3 Seipin及Bax蛋白表達

Western blot結果顯示，通過與正常組和陰性組相比，過表達組Seipin蛋白表達量明顯升高；且凋亡相關蛋白Bax降低，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖3。

注：A為Western blot蛋白條帶圖，B為Bax條帶灰度值統計圖，C為Seipin條帶灰度值統計圖；(1)與正常組和陰性組比較，P<0.05。

2.4 細胞核內DNA斷裂情況

TUNEL試劑盒檢測細胞凋亡晚期過程中細胞核DNA斷裂情況，將斷裂的DNA標記上綠色熒光，結果顯示Seipin過表達組細胞核熒光強度相比正常組和陰性組較弱。見圖4。

圖4 TUNEL凋亡試劑盒檢測PC12細胞凋亡(標尺20 μm)

3 討論

Seipin是人類先天性脂肪營養不良2型基因編碼的蛋白，其高表達于大腦、睪丸、全身脂肪細胞，并定位于內質網，是一個有重要的蛋白，目前研究主要圍繞脂質代謝、神經、腎研究[16-18]。Seipin在大腦中高表達，有研究發現Seipin與神經疾病密切相關，且Karin等[9-10]對病理確診的PD患者和年齡和性別匹配的正常人死后藍斑核組織進行蛋白質組分析，發現Seipin在PD患者中表達量下調，于是本研究通過構建Seipin高表達組，觀察Seipin表達量增高后對細胞凋亡的作用。通過慢病毒感染將帶有紅色熒光蛋白的Seipin過表達載體導入PC12細胞，熒光顯微鏡觀察到紅色熒光，初步判斷載體導入細胞內。通過Real time PCR定量BSCL2 mRNA相對水平，Seipin過表達組內BSCL2 mRNA明顯升高。Western blot檢測Seipin蛋白的表達水平，Seipin過表達組Seipin蛋白水平明顯高于正常組和陰性組。Western blot檢測凋亡相關蛋白Bax的表達水平，過表達組中Bax較正常組和陰性組降低，差異有統計學意義；經TUNEL染色觀察到相對正常組和陰性對照組，過表達組細胞核內斷裂DNA染成綠色的熒光較弱，進一步判斷Seipin過表達后可能對細胞有一定的保護作用。

綜上所述，本研究成功構建過表達的PC12細胞，發現在Seipin表達量高的情況該細胞株的凋亡相關蛋白Bax及斷裂DNA減少，提示Seipin可能對細胞有保護作用，但具體機制需要進一步進行研究。