黃芩素通過Nrf2/NF-κB/NFATc1信號通路對牙周病大鼠破骨細胞形成和牙槽骨吸收的影響▲

畢 磊 劉 輝 武 燃

(華北理工大學附屬醫院口腔正畸修復科，河北省唐山市 063000，電子郵箱：bilei18631575530@163.com)

牙周病是由細菌感染引起的一種慢性炎性疾病，可導致牙齦發炎、牙槽骨損傷，牙周炎患者常出現牙齦出血、袋囊炎等癥狀[1-2]。牙周病引起機體成骨形成與破骨吸收失衡，過多的骨吸收與牙槽骨損傷密切相關[3]。破骨細胞主要發揮骨吸收作用，其分化由多種因子共同調控[4]。核因子κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)與其配體結合可活化活化T細胞核因子c1(nuclear factor of activated T-cells，cytoplasmic 1，NFATc1)，參與調控破骨細胞的分化[5]。此外，牙周組織中炎性細胞因子、趨化因子的產生以及氧化應激反應可加劇牙周病的發生[6]。核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)是機體抗氧化應激的主要調控因子，在氧化應激、炎癥、凋亡等過程中發揮重要作用[7]。Nrf2通過抑制NF-κB核轉位，上調抗氧化酶的表達，降低細胞內的活性氧水平，從而抑制破骨細胞的分化[8]。黃芩素是黃芩屬草本植物的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗微生物及免疫調節等生物學功能[9]。研究表明，黃芩素可以通過調節Nrf2信號通路，減少牙槽骨丟失[10]。但關于黃芩素對牙周病患者破骨細胞的影響的研究較少。故本研究探討黃芩素對牙周病大鼠破骨細胞形成牙槽骨吸收的影響，并探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體級雄性SD大鼠40只，6～8周齡，體重180～210 g，由本院實驗動物中心提供。實驗動物生產許可證號：SCXK 2018-0004；實驗動物使用許可證號：SYXK 2018-0051；動物質量合格證號：19061708。

1.2 主要試劑及儀器 黃芩素(批號：MB6699)購自美侖生物科技有限公司；白細胞介素(interleukin，IL)-1β酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(批號：ml063132)、IL-6 ELISA試劑盒(批號：ml063159)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA試劑盒(批號：ml002095)均購自上海酶聯生物科技公司；活性氧初級綠色熒光測定試劑盒(批號：HL100164)購自上海哈靈生物科技有限公司；谷胱甘肽ELISA試劑盒(批號：BC1175)、丙二醛ELISA試劑盒(批號：BC0025)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)ELISA試劑盒(批號：BC0175)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)檢測試劑盒(批號：G1492)均購自北京索萊寶科技有限公司；兔多克隆Nrf2抗體(批號：ab92946)、兔多克隆NF-κB抗體(批號：ab7549)、兔單克隆甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(批號：ab181602)購自英國Abcam公司；鼠單克隆NFATc1抗體(批號：sc-7294)購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(批號：BHR101)購自北京博爾西科技有限公司；酶聯免疫分析儀(型號：EVO75)購自澳大利亞Techan公司；超低溫冰箱(型號：MDF-U32V)購自美國Thermo公司；手術器械(型號：11231-220-230)購自北京友誠嘉業生物科技有限公司；生物顯微鏡(型號：Eclipse E200)購自日本尼康公司；凝膠成像系統(型號：GelDoc EZ)購自美國伯樂公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組牙周病大鼠模型的構建：將SD雄性大鼠按隨機數字表法分為對照組、模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組，每組10只。除對照組外，其他組制備牙周病大鼠模型。用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，麻醉劑量為0.2 mL/100 g；用4.0絲線伸入齦溝，結扎大鼠上頜右側第二磨牙，采用眼科細剪割破牙齦，劃入齦溝1 mm深[11]。造模1周后，觀察大鼠牙周情況，如存在牙齦處紅腫、探診出血、深牙周袋形成則確認牙周炎模型構建成功。分別在黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠上頜右側第一和第二磨牙間腭側、頰側的齦溝底注入黃芩素，劑量分別為2.5 mg/(kg·d)、5.0 mg/(kg·d)，1次/d，在對照組與模型組大鼠相同位置注入等量生理鹽水，均連續給藥7 d。

1.3.2 標本采集：末次給藥后禁食12 h，取各組大鼠尾靜脈血4 mL，靜置后室溫下3 500 r/min離心10 min，留取血清，-80℃儲存備用。用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉處死大鼠，分離右側磨牙區段頜骨并用4%多聚甲醛固定備用；取牙周組織，剪取約0.5 g儲存在-80℃冰箱中備用，剩余牙周組織置于4%多聚甲醛中固定，做常規石蠟切片，備用。

1.3.3 影像學檢測大鼠牙槽骨吸收情況：取1.3.2中用4%多聚甲醛固定的磨牙區段頜骨，進行三維CT拍攝，測量釉牙骨質界至牙槽嵴頂(cementum-enamel junction to alveolar bone crest，CEJ-ABC)的距離，測量3次后取均值代表牙槽骨吸收度。

1.3.4 蘇木精-伊紅染色法觀察大鼠牙周組織病理變化：取1.3.2中制備的牙周組織切片，脫蠟至水化，蘇木精染色、伊紅染液復染，不同梯度乙醇脫水，透明，封片，鏡下觀察牙周組織病理變化。

1.3.5 TRAP染色法計數大鼠牙周組織破骨細胞：將1.3.2中制備的牙周組織切片常規脫蠟水化，然后按照TRAP檢測試劑盒說明書步驟進行染色，吹干后，用中性明膠封片，顯微鏡下觀察并進行破骨細胞計數。將細胞核為藍色、細胞質為紅色的細胞判定為破骨細胞，鏡下隨機選取5個視野(200倍)，計數破骨細胞個數，取平均數。

1.3.6 檢測大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、丙二醛、谷胱甘肽水平及活性氧、SOD活性：取1.3.2中保存的血清，采用ELISA法檢測血清IL-1β、IL-6、TNF-α、丙二醛、谷胱甘肽水平及SOD活性，采用活性氧初級綠色熒光測定試劑盒檢測活性氧活性，具體操作步驟均參考其說明書。

1.3.7 蛋白質印跡法檢測大鼠牙周組織Nrf2、NF-κB、NFATc1蛋白表達水平：取牙周組織，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA組織裂解液，研磨后，12 000 r/min離心30 min，留取上清液，采用二喹啉甲酸法檢測蛋白濃度；調整上樣蛋白至50 μg，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜、加一抗(兔多克隆Nrf2抗體、兔多克隆NF-κB抗體、鼠單克隆NFATc1抗體、兔單克隆GAPDH抗體的稀釋比例均為1 ∶1 000)，4℃孵育過夜；次日加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1 ∶3 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜，加電化學發光液，采用Bio-Rad成像系統檢測蛋白灰度，采用Image J軟件定量分析Nrf2、NF-κB、NFATc1蛋白表達水平。目的蛋白相對表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參(GAPDH)蛋白條帶灰度值。

1.4 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計量資料以 (x±s)表示，多組間比較方差齊時行單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，方差不齊時采用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 4組大鼠牙槽骨吸收情況 與對照組相比，模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠牙槽骨吸收度升高(均P<0.05)；模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠牙槽骨吸收度依次降低(均P<0.05)。見圖1及表1。

圖1 4組大鼠牙槽骨吸收情況三維CT圖像

表1 4組大鼠牙槽骨吸收度的比較(x±s ，mm)

2.2 4組大鼠牙周組織病理學變化 對照組大鼠牙周組織無明顯病理變化，表現為纖維排列整齊，無炎癥細胞浸潤；模型組大鼠牙周組織上皮增生，膠原纖維排列紊亂，有大量炎癥細胞浸潤；黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠牙周組織炎癥細胞浸潤較模型組明顯減少。見圖2。

圖2 4組大鼠牙周組織病理變化(蘇木精-伊紅染色，標尺=50 μm，×200)

2.3 4組大鼠牙周組織破骨細胞數量的比較 與對照組相比，模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠牙周組織破骨細胞數增多(均P<0.05)；模型組相、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠牙周組織破骨細胞數依次減少(均P<0.05)。見圖3及表2。

圖3 4組大鼠牙周組織破骨細胞鏡下圖像(TRAP染色，標尺=50 μm，×200)

表2 4組大鼠牙周組織破骨細胞數量的比較(x±s，個)

2.4 4組大鼠血清炎癥因子水平的比較 與對照組相比，模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠血清炎癥因子IL-1β、TNF-α水平升高(均P<0.05);模型組、黃芩素低劑量組大鼠血清IL-6水平均高于對照組與黃芩素高劑量組(均P<0.05)，而對照組與黃芩素高劑量組血清IL-6水平差異無統計學意義(P>0.05)；模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平依次降低(均P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠血清炎癥因子水平的比較(x±s，pg/mg)

2.5 4組大鼠血清氧化應激因子及谷胱甘肽、丙二醛水平的比較 與對照組相比，模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠血清谷胱甘肽水平、SOD活性降低，活性氧活性升高，模型組、黃芩素低劑量組大鼠血清丙二醛水平升高(均P<0.05)；模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠血清SOD活性依次升高，丙二醛水平、活性氧活性依次降低(均P<0.05)，黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠血清谷胱甘肽水平均高于模型組(均P<0.05)，而黃芩素低劑量組與黃芩素高劑量組的谷胱水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 4組大鼠血清氧化應激因子及谷胱甘肽、丙二醛水平的比較(x±s)

2.6 4組大鼠牙周組織Nrf2、NF-κB、NFATc1蛋白表達水平的比較 與對照組相比，模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠牙周組織Nrf2蛋白表達水平降低，NF-κB、NFATc1蛋白表達水平升高(均P<0.05)；模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠牙周組織Nrf2蛋白表達水平依次升高，NF-κB、NFATc1蛋白表達水平依次降低(均P<0.05)。見圖4及表5。

圖4 4組大鼠牙周組織Nrf2/NF-κB/NFATc1信號通路相關蛋白相對表達水平

表5 4組大鼠牙周組織Nrf2、NF-κB、NFATc1蛋白相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

牙周病是常見的口腔疾病，是導致患者牙齒喪失的主要原因，嚴重影響人們的身體健康和生活質量。牙槽骨吸收是牙周病的主要病理特征，本研究結果顯示，與對照組相比，模型組大鼠牙周組織上皮增生，膠原纖維排列紊亂，有大量炎癥細胞浸潤，模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠牙槽骨吸收度升高(P<0.05)，這與胡芳等[12]的研究結果相似。以上結果提示牙周病大鼠模型構建成功。黃芩素是從唇形科植物黃芩中提取的一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒等作用[13]。本研究結果顯示，與模型組相比，黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠牙周組織炎癥細胞浸潤明顯減少，且以上3組的牙槽骨吸收度依次降低(P<0.05)，提示黃芩素可以降低牙槽骨吸收度，減輕牙周病癥狀，且呈劑量依賴性。

破骨細胞是一種多核巨細胞，與骨吸收過程密切相關，在牙周炎、骨質疏松癥等多種溶骨性疾病的發生和發展過程中具有至關重要的作用[14]。NFATc1可介導破骨細胞分化，在破骨細胞生長過程中發揮作用，研究顯示牙周炎小鼠體內NFATc1表達水平升高，破骨細胞增多[15]。本研究結果顯示，與對照組相比，模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠牙周組織破骨細胞數增多，NFATc1蛋白表達水平升高(P<0.05)，提示破骨細胞及NFATc1與牙周病的發生密切相關。付方勝等[16]的研究顯示，黃芩素可以抑制破骨細胞分化。本研究結果也顯示，模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠牙周組織破骨細胞數依次減少，NFATc1蛋白表達水平依次降低(P<0.05)，提示黃芩素可以降低牙周組組織中NFATc1蛋白表達水平，并有效抑制牙周組織中破骨細胞的產生。在病理條件下，活化的免疫細胞分泌的多種促炎細胞因子有助于破骨細胞的分化和活化[3]。本研究結果顯示，與對照組相比，模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)，這與Yu等[17]的研究結果相似，提示牙周病大鼠體內炎性因子分泌增加，引起機體炎癥反應。Li等[18]的研究顯示，黃芩素可以有效降低牙齦上皮細胞IL-1β、IL-6表達水平，有顯著抗炎作用。本研究結果也顯示，模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平依次降低(P<0.05)，提示黃芩素可以減少炎性因子的分泌，減輕炎癥反應。由此推測黃芩素可以通過抑制炎癥因子分泌，從而減少破骨細胞生成，進而減少牙槽骨吸收。

機體內氧化應激與牙周炎的發生和發展密切相關，在牙周炎病中內源性氧化應激水平增加[19]。活性氧的產生和抗氧化系統之間的平衡在牙周健康中起著重要作用，機體中活性氧過量會引起氧化應激[20]，谷胱甘肽、SOD、丙二醛共同參與機體的氧化反應，是評價氧化應激的常用指標。本研究結果顯示，與對照組相比，模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠血清氧化應激因子谷胱甘肽水平、SOD活性降低，活性氧活性升高，模型組、黃芩素低劑量組大鼠血清丙二醛水平升高(P<0.05)，提示牙周病引起機體氧化應激反應。而模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠血清氧化應激因子谷胱甘肽水平、SOD活性依次升高，丙二醛水平、活性氧活性依次降低(P<0.05)，提示黃芩素可以減輕牙周病大鼠的氧化應激反應。

Nrf2是機體抗氧化系統的主要調控因子，通過與編碼基因啟動子區域中的抗氧化反應元件結合，其不僅可以上調SOD、血紅素加氧酶-1等解毒基因和抗氧化劑的表達，還可以抑制細胞因子、炎癥趨化因子、細胞黏附因子等促炎因子的表達[21-22]。NF-κB介導TNF-α、IL-6、IL-8等細胞因子和趨化因子產生，在控制炎癥損傷中起關鍵作用[23]。Qi等[24]的研究顯示，激活Nrf2信號通路可以抑制NF-κB活化，從而減輕人牙齦成纖維細胞的炎癥反應。本研究結果顯示，與對照組相比，模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠牙周組織Nrf2蛋白表達水平降低，NF-κB蛋白表達水平升高(P<0.05)，提示牙周病的發生與Nrf2、NF-κB相關；而模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組大鼠牙周組織Nrf2蛋白表達水平依次升高，NF-κB蛋白表達水平依次降低(P<0.05)，提示黃芩素可能通過調控Nrf2/NF-κB信號通路相關蛋白的表達以抑制炎性因子分泌，從而減少破骨細胞增加，降低牙槽骨吸收度。

綜上所述，黃芩素可能通過調節Nrf2/NF-κB/NFATc1信號通路，抑制機體炎癥反應、氧化應激反應，從而減少破骨細胞增加，進而降低牙槽骨吸收度，有效緩解牙周病癥狀。但其具體作用機制仍需進一步研究。