芝麻素對人外周血中γδ T細胞體外增殖及殺傷胃癌細胞株BCG-823作用的影響▲

王增慧 張傳禎 吳 倩 劉 煥 湯琳琳 胡 超 馮均軍 陳復興 周忠海 朱 云

(1 徐州醫科大學附屬淮海醫院消化內科，江蘇省徐州市 221004，電子郵箱：wang97yy@163.com；中國人民解放軍陸軍第七十一集團軍醫院2 消化內科，3 麻醉科，4 檢驗-病理科，江蘇省徐州市 221004)

芝麻素是天然的木脂類化合物，在芝麻油和芝麻種子中含量均較高，其藥理作用十分廣泛，如抗氧化、穩定血壓、調節血脂、保護肝臟及抑制腫瘤生長等[1-2]。日本東京大學醫學院所開展的研究證實芝麻素具有抗腫瘤的功效，低濃度的芝麻素飲食可能對肝癌有抑制作用[3]，國內也有研究證實芝麻素對肝癌細胞的增殖具有抑制作用[4-5]。近年來，γδ T細胞在抗腫瘤方面的作用逐漸受到國內外學者們的廣泛關注，其主要分布在黏膜及上皮組織內，主要通過主要組織相容性復合物以非限制性方式，以及通過其固有免疫和適應性免疫的輔助作用，來識別及殺傷腫瘤細胞[6-8]。提高γδ T細胞的增殖率及增強其功能，有利于更有效地將γδ T細胞應用于生物學研究以及發揮其臨床抗腫瘤作用。因此，本研究探討芝麻素對人外周血中γδ T細胞體外增殖及殺傷胃癌細胞株BCG-823作用的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 GT-T551無血清培養基(日本TAKARA公司，批號：AK2P027)；淋巴細胞分離液(中國科學院血液病研究所，批號：LTS1077)；芝麻素(Sigma公司，批號：#028M4099V)；人胃癌細胞株BCG-823(中國科學院上海細胞庫，編號：BNO0102269)；胰蛋白酶(Gibco公司，批號：011020200528)；重組人白細胞介素(interleukin，IL)-2(雙鷺藥業，批號：S19991007)；異戊烯焦磷酸(美國Sigma-Aldrich公司,批號：SLCB2751)；流式細胞儀(美國BD公司，型號：BD-FACSCalibur)；酶標儀(上海科華實驗系統有限公司，型號：ST-360)；貝克曼自動生化分析儀(美國貝克曼，型號：AU680)；細胞計數檢測(cell counting kit-8，CCK-8)試劑(上海碧云天生物技術公司，批號：010919190408)；γδ T細胞抗體(美國BD公司，批號：6029567)； 穿孔素單抗(eBioscience公司，批號：E020894)、顆粒酶B單抗(eBioscience公司，批號E106781638)、CD107a單抗(eBioscience公司，批號：B181677)、Fix&Perm破膜劑(eBioscience公司，批號：749349340)；乳酸脫氫酶試劑 (寧波普瑞柏生物技術公司，批號：LD0359)。

1.2 實驗方法

1.2.1 γδ T細胞的培養及表型鑒定：取5名健康男性志愿者(平均年齡為35周歲)外周血各100 mL，肝素抗凝，各取100 μL抗凝血采用異硫氰酸熒光素標記的γδ T細胞抗體進行標記，用流式細胞儀檢測γδ T細胞的表型。剩下的抗凝血分別采用淋巴細胞分離液分離后吸取單個核細胞層，加入50 mL磷酸緩沖鹽溶液洗滌1遍后，室溫下1 500 r/min離心5 min，棄去上清，沉淀即為獲得的外周血單個核細胞，將加入GT-T551無血清培養基(含誘導γδ T細胞的細胞因子，購自美國Sigma公司)中，調整細胞濃度為1×108個/mL，放入培養瓶后置于37℃、5% CO2培養箱中，每天觀察γδ T細胞生長情況并適量補充培養基；培養10 d后，收集部分γδ T細胞，室溫下1 500 r/min離心5 min，磷酸緩沖鹽溶液洗滌2遍，用異硫氰酸熒光素標記的γδ T細胞抗體進行標記，用流式細胞儀檢測γδ T細胞的表型；當γδ T細胞的表型百分率達到80%以上時方可繼續采用此細胞進行以下實驗。

1.2.2 胃癌細胞株的培養：從液氮中取出BCG-823胃癌細胞株，經復蘇后接種于GT-T551無血清培養基中，置于37℃、5% CO2培養箱中，每天觀察BCG-823胃癌細胞生長情況并適量補充培養基。

1.2.3 CCK-8法檢測γδ T細胞的增殖情況：取培養10 d且生長狀態較好的γδ T細胞接種于96孔板中，每孔培養基200 μL，調整細胞密度為1×105個/孔，加入2 μL不同濃度(濃度分別為0 μg/mL、0.156 μg/mL、0.313 μg/mL、0.625 μg/mL、1.250 μg/mL、2.500 μg/mL、5.000 μg/mL、10.000 μg/mL、20.000 μg/mL、40.000 μg/mL、80.000 μg/mL、100.000 μg/mL)的芝麻素誘導，設未加細胞及芝麻素組為空白組，0 μg/mL芝麻素為對照組，其余各濃度芝麻素組為實驗組。每個濃度設5個復孔。37℃、5% CO2培養箱中孵育48 h后，每孔加入20 μL CCK-8液，置于37℃、5% CO2培養箱中孵育4～6 h后，測定490 nm波長下各孔的吸光度值，計算細胞增殖率。增殖率=(實驗組吸光度值-空白組吸光度值)/(對照組吸光度值-空白組吸光度值)×100%。

1.2.4 流式細胞儀檢測γδ T細胞中顆粒酶B、穿孔素、CD107a的表達：取培養10 d的γδ T細胞接種于6孔板中，1×108個/孔，選取增殖效果較好的芝麻素濃度(濃度分別為0.156 μg/mL、0.313 g/mL、0.625 μg/mL、1.250 μg/mL、2.500 μg/mL)進行誘導，每個濃度設3個復孔，繼續于37℃、5% CO2培養箱中孵育48 h，收集細胞，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌后室溫下1 500 r/min離心5 min，重復2遍，每管分別加入異硫氰酸熒光素標記的γδ T抗體、顆粒酶B單抗、穿孔素單抗、CD107a單抗 ，室溫下避光孵育15 min，磷酸緩沖鹽溶液洗滌后室溫下1 500 r/min離心5 min，重復2遍，用流式細胞儀檢測γδ T細胞中顆粒酶B、穿孔素、CD107a的表達水平。

1.2.5 乳酸脫氫酶釋放法檢測γδ T細胞的殺傷活性：以對數生長期的BCG-823細胞株作為靶細胞，以經不同濃度(分別為0 μg/mL、0.156 μg/mL、0.313 μg/mL、0.625 μg/mL、1.250 μg/mL、2.500 μg/mL、 5.000 μg/mL、10.000 μg/mL)芝麻素誘導且在37℃、5% CO2培養箱中孵育48 h后的γδ T細胞為效應細胞，其中0 μg/mL的芝麻素為對照組。調整靶細胞濃度為2×105個/mL，調整效應細胞濃度為2×106個/mL，將效靶細胞按體積比為10 ∶1比例混合置于試管中，每個濃度設3個復管。500 r/min離心3 min后置于37℃、5% CO2培養箱中孵育6 h，1 500 r/min離心10 min，吸取上清液，加入乳酸脫氫酶試劑后在生化分析儀上測定各管上清液的活性單位，計算γδ T細胞的殺傷活性。設經各濃度芝麻素誘導后的γδ T細胞與BCG-823細胞混合的試管為測定管，只加BCG-823細胞與培養基的試管為靶細胞自然釋放管，只加γδ T細胞和培養基的試管為效應細胞自然釋放管，BCG-823細胞與乙基苯基聚乙二醇溶液按體積比為10 ∶1混合的試管為靶細胞最大釋放管。γδ T細胞的殺傷活性=(測定管活性單位-效應細胞自然釋放管)/(靶細胞最大釋放管-靶細胞自然釋放管)×100%。

1.3 統計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 γδ T細胞表型鑒定 培養前外周血中γδ T細胞百分率約為6.14%，培養10 d后外周血中γδ T細胞百分率高達90.34%，見圖1。

培養前 培養10 d后

2.2 不同濃度芝麻素對γδ T細胞增殖的影響 與對照組相比，0.156 μg/mL、0.313 μg/mL、0.625 μg/mL、1.250 μg/mL、2.500 μg/mL芝麻素組的γδ T細胞增殖率均升高(P<0.05)，當芝麻素濃度為1.250 μg/mL時γδ T細胞增殖率最高；而當芝麻素濃度達到5.000 μg/mL以上時，對γδ T細胞的生長起抑制作用。見表1。

表1 不同濃度芝麻素對γδ T細胞增殖率的影響(x±s，%)

2.3 不同濃度芝麻素對γδ T細胞中顆粒酶B、穿孔素和CD107a表達的影響 0.625 μg/mL、1.250 μg/mL、2.500 μg/mL芝麻素組γδ T細胞的顆粒酶B表達水平均高于對照組(均P<0.05)，2.500 μg/mL芝麻組的表達水平最高。0.156 μg/mL、0.313 μg/mL、0.625 μg/mL、1.250 μg/mL及2.500 μg/mL芝麻素組γδ T細胞的穿孔素表達水平均高于對照組(均P<0.05)，2.500 μg/mL芝麻組的表達水平最高。0.313 μg/mL、0.625 μg/mL、1.250 μg/mL及2.500 μg/mL芝麻素組 γδ T細胞的CD107a表達水平均高于對照組(均P<0.05)。見表2。

表2 不同濃度芝麻素作用48 h后γδ T細胞中顆粒酶B、穿孔素及CD107a的表達水平(x±s，%)

2.4 不同濃度芝麻作用后γδ T細胞對胃癌細胞BCG-823的殺傷活性 0.156 μg/mL、0.313 μg/mL、0.625 μg/mL、1.250 μg/mL、2.500 μg/mL、5.000 μg/mL芝麻素作用48 h后，γδ T細胞對胃癌細胞BCG-823的殺傷活性均高于對照組(均P<0.05)，且在芝麻素濃度為2.500 μg/mL時對胃癌細胞BCG-823的殺傷活性最高，見表3。

表3 不同濃度芝麻素作用后γδ T細胞對胃癌細胞BCG-823的殺傷活性(x±s，%)

3 討 論

研究證實，芝麻素具有抗氧化、清除自由基、改善脂代謝、降壓降糖、抗癌、殺菌、免疫調節、保肝護腎及神經保護等功效[9-11]。近年來，國內外研究均顯示芝麻素具有抗腫瘤特性，其可通過抑制腫瘤細胞的增殖，引起腫瘤細胞周期阻滯，觸發腫瘤細胞凋亡[6,12-15]。凋亡是由基因調控下游死亡信號誘發的細胞主動程序性死亡，而芝麻素可能通過激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-3、Caspase-8和Caspase-9等通路，誘導腫瘤細胞凋亡[16-17]。

γδ T細胞是存在于人體黏膜組織的固有免疫細胞，具有免疫調節的功能及非特異性免疫的特性，對于人體維持免疫穩態具有重要作用[18]。隨著細胞體外培養技術的成熟，γδ T細胞可單獨使用，或者與其他免疫細胞如記憶T細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞等聯合應用治療多種腫瘤，且具有較好的療效[7,19]。γδ T細胞主要是通過主要組織相容性復合物，以非限制性的形式特異性識別腫瘤抗原，并釋放顆粒酶、穿孔素來殺傷腫瘤細胞[20]。γδ T細胞還可以通過自然殺傷細胞2族成員D與其配體的相互作用，殺傷具有相應配體的腫瘤細胞[20]。此外，γδ T細胞還可通過穿孔素-顆粒酶途徑、Fas/Fas配體途徑，以及分泌腫瘤壞死因子α、γ-干擾素、IL-12等細胞因子，來發揮其抗腫瘤作用[21]。

學者們在如何提高γδ T細胞的體外培養細胞數量和增強其殺傷功能方面進行了很多研究，證實了IL-15、IL-21、CD28單克隆抗體等生物制劑和一些中藥單體成分可以增強γδ T細胞體外培養的擴增效率及其抗腫瘤細胞毒活性[22-23]。芝麻素是一種木脂類中藥單體成分，但將其應用于體外誘導擴增γδ T細胞以及免疫治療，未見有研究報告。本研究結果顯示，與對照組相比，0.156 μg/mL、0.313 μg/mL、0.625 μg/mL、1.250 μg/mL、2.500 μg/mL芝麻素組的γδ T細胞增殖率均升高(P<0.05)，而當芝麻素濃度大于5.000 μg/mL時，對γδ T細胞的生長起抑制作用，提示適當濃度的芝麻素對γδ T細胞的增殖有促進作用，這為將芝麻素作為γδ T細胞免疫調節劑提供了實驗依據。

本研究結果顯示，0.625 μg/mL、1.250 μg/mL、2.500 μg/mL芝麻素組γδ T細胞的顆粒酶B表達水平均高于對照組(P<0.05)；0.156 μg/mL、0.313 μg/mL、0.625 μg/mL、1.250 μg/mL及2.500 μg/mL芝麻素組γδ T細胞的穿孔素表達水平均高于對照組(P<0.05)；0.313 μg/mL、0.625 μg/mL、1.250 μg/mL及2.500 μg/mL芝麻素組 γδ T細胞的CD107a表達水平均高于對照組(P<0.05)；0.156 μg/mL、0.313 μg/mL、0.625 μg/mL、1.250 μg/mL、2.500 μg/mL、5.000 μg/mL芝麻素作用48 h后γδ T細胞對胃癌細胞BCG-823的殺傷活性均高于對照組(P<0.05),提示適宜濃度的芝麻素可能通過上調γδ T細胞中顆粒酶B-穿孔素通路及CD107a的表達，來增強其對腫瘤細胞殺傷活性。

綜上所述，采用適宜濃度的芝麻素誘導人外周血γδ T細胞，可提高γδ T細胞的增殖率及殺傷胃癌細胞BCG-823的功能，機制可能與其上調γδ T細胞的顆粒酶B-穿孔通路和CD107a的表達有關。