HBV相關慢性肝病患者血清原卟啉Ⅸ檢測的臨床意義

張 瓔，成若晨，郭 蕊，王 霞，劉凱歌

1 西安醫學院第二附屬醫院 康復醫學科，西安 710038； 2 西安醫學院 臨床醫學院1625班，西安 710068；3 咸陽市中心醫院 老年病科，陜西 咸陽 712000； 4 西安醫學院第一附屬醫院 消化內科，西安 710077

慢性乙型肝炎(CHB)是常見的慢性、進行性肝病，其發病率高，CHB可進展為肝纖維化、肝硬化(LC)甚至肝細胞癌(HCC)。我國LC和HCC 患者由HBV所致者分別為77%和84%[1]，死亡率高。因此，延緩及阻斷肝病進展對改善預后至關重要，其關鍵是肝損傷的早期預警、評估及治療。目前各臨床檢測指標均有一定的局限性，進一步尋找新的指標具有重要意義。原卟啉Ⅸ(protoporphyrins Ⅸ，PPⅨ)是血紅素生物合成途徑的最終中間體，其水平變化與肝臟疾病關系密切[2]。本研究擬通過探討PPⅨ檢測在HBV相關慢性肝病患者肝損傷中的價值，以期為HBV相關慢性肝病的診治提供借鑒。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究病例組為2018年10月—2019年10月就診于西安醫學院第一附屬醫院診斷為HBV相關慢性肝病患者110例，其中CHB患者50例，LC患者40例，HCC患者20例。CHB患者根據轉氨酶是否升高進一步分為靜止期(轉氨酶正常)與活動期(轉氨酶升高)，LC患者根據Child-Pugh評分分為代償期(Child-Pugh A級)與失代償期(Child-Pugh B、C級)。納入標準：參照《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[3]。排除標準：(1)原發性卟啉病、繼發性卟啉病非肝臟因素(如鉛中毒、巴比妥、磺胺、卡馬西平及其他非甾體類抗炎藥、雌激素等導致者；(2)合并嚴重心、腦、腎、肺、血液、內分泌等原發疾病者；(3)非HBV感染的慢性肝病，如非酒精性脂肪肝、酒精性肝病、藥物性肝炎、丙型肝炎、自身免疫性肝病、血吸蟲性肝病等；(4)系統性紅斑狼瘡、干燥綜合征等自身免疫性疾病。對照組為同一時期在本院健康體檢人群40例，經檢查均無HBV感染，肝功能均在正常范圍，也無其他疾病。

1.2 檢測項目及方法

1.2.1 常規檢查 常規檢查均在本院完成，包括HBV血清標志物(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc)、HBV DNA定量、AFP、血常規、肝功能、凝血功能等指標。肝膽胰脾彩超、FibroScan、腹部CT、胃十二指腸鏡等檢查均由操作熟練、經驗豐富的醫師完成。

1.2.2 血清PPⅨ檢測 血清樣品來自于西安醫學院第一附屬醫院，禁食、禁水12 h后，清晨空腹采集5 ml外周靜脈血避光離心，取上清液分裝于1.5 ml避光EP管中-80 ℃凍存。采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)檢測血清PPⅨ，在西安醫學院藥物分析測試中心完成。

(1)主要儀器及試劑：安捷倫1260 HPLC儀、配套二元泵、熒光檢測器以及數據處理軟件工作站(Agilent，美國)。PPⅨ標準品(上海源葉生物科技有限公司)。

(2)色譜條件：美國Agilent 5 TC-C18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm),柱溫30 ℃；流動相 A純凈水(含0.5%冰乙酸)，B甲醇∶乙腈∶DMF=45∶45∶10，以B∶A=95∶5等度洗脫。流速1 ml/min，激發波長400 nm，發射波長630 nm,增益16。

(3)PPⅨ標準品混合液配置：精密稱取PPⅨ標準品1 mg溶于1 ml DMF溶液中配置濃度為1 mg/ml的標準溶液，再逐級稀釋至濃度分別為100、70、30、10、7、3、1 ng/dl，作為實驗中測定血清中PPⅨ的校正集。

(4)標準曲線繪制：按上述色譜條件及稀釋濃度進行分析，每次進樣20 μl，連續進樣3次取平均峰面積為縱坐標，標準品濃度為橫坐標(ng/dl)，繪制標準曲線為Y=0.246 4X+0.308 6，R2=0.999 8，最低檢測濃度0.1 ng/dl，標準曲線檢測范圍：1～100 ng/dl。

(5)血樣處理及檢測：解凍血漿樣品300 μl加700 μl甲醇定容至1 ml，震蕩，高速冷凍離心后取上清液進行含量測定，每份樣品進樣3次取平均值。根據標準曲線計算被檢者血清PPⅨ。HPLC法檢測PPⅨ標品、血樣出峰圖像如下(圖1)。

注：a，原卟啉Ⅸ標準品；b，對照組；c，病例組。

1.3 倫理學審查 本研究方案經由西安醫學院第一附屬醫院倫理委員會審批，批號：XYYFY2021LSK-002，所有研究對象均簽署知情同意書。

2 結果

2.1 基本資料的比較 CHB組、LC組、HCC組與對照組在性別、年齡上比較，差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表1)。

表1 患者基本資料的比較

2.2 各組血清PPⅨ檢測結果 (1)Kruskal-WallisH檢驗顯示，CHB、LC、HCC 3組肝病患者血清PPⅨ顯著高于對照組[44.29(25.99～85.36)ng/dl、72.73(48.28～90.43)ng/dl、91.79(68.34～121.52)ng/dl vs 15.43(10.87～20.16)ng/dl]，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。HCC組較CHB、LC組PPⅨ顯著升高，差異均有統計學意義(P值均<0.05)(圖2)。(2)Mann-WhitneyU檢驗顯示，與代償期LC患者相比較，失代償期LC患者PPⅨ顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；而CHB患者活動期與靜止期PPⅨ比較，差異無統計學意義(P>0.05)(表2)。

圖2 對照組與病例組血清PPⅨ水平

表2 CHB與LC患者組內PPⅨ水平

2.3 PPⅨ診斷HBV相關慢性肝病的效能 ROC曲線顯示，PPⅨ診斷CHB的曲線下面積(AUC)為0.873，95%CI：0.797～0.949，利用約登指數確定臨界值為20.325ng/dl，其敏感度為86%，特異度為77.5%；診斷LC的AUC為0.748，95%CI：0.659～0.838，臨界值為33.695 ng/dl，其敏感度為90%，特異度為61.1%；診斷HCC的AUC為0.812，95%CI：0.729～0.896，臨界值為65.26 ng/dl，其敏感度為85%，特異度為69.2%(圖3)。

注：a，PPⅨ診斷CHB的ROC曲線；b，PPⅨ診斷LC的ROC曲線；c，PPⅨ診斷HCC的ROC曲線。

2.4 CHB靜止期與對照組PPⅨ及肝功能比較 靜止期CHB患者肝功能指標除ChE較健康對照組升高外(P=0.032)，其余指標與對照組相比較，差異均無統計學意義(P值均>0.05)；而CHB患者的PPⅨ顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)(表3)。

表3 CHB患者靜止期與對照組PPⅨ及肝功能指標比較

2.5 PPⅨ與各肝功能評估指標的相關性分析 CHB患者PPⅨ與各指標均不存在相關性(P值均>0.05)；LC患者PPⅨ與TBil呈中等正相關(rs=0.587，P<0.05)，與Alb呈中等負相關(rs=-0.408，P<0.05)；HCC患者PPⅨ與TBil呈中等正相關(rs=0.470，P<0.05)，與ChE呈中等負相關(rs=-0.459，P<0.05)(表4)。

表4 PPⅨ與各指標的相關性分析

3 討論

HBV感染是全球最重大公共衛生安全問題之一，可進展為CHB甚至LC、HCC等終末期肝病，給患者和社會造成沉重的負擔，同時擠占大量的醫療資源。而早期預防及治療，對于阻止疾病進展及改善預后具有重要意義。CHB的發病機制較為復雜，迄今尚未完全闡明，目前認為肝細胞損害主要是由HBV引起的免疫應答反應所導致[1]。此外，HBV誘導線粒體氧化應激、線粒體自噬以及釋放炎性因子可能是肝病進展的重要原因[4]。PPⅨ是血紅素生物合成途徑的最終中間體，起始和終末兩個關鍵步驟均在肝細胞線粒體進行[2]，遺傳性和后天性疾病以及某些外源生物可能干擾血紅素的合成和PPⅨ的體內平衡，導致PPⅨ的蓄積[5]。大量的PPⅨ具有肝毒性，損害肝細胞和膽管細胞，肝細胞損傷后肝臟對PPⅨ的清除作用進一步減弱，血漿和紅細胞中PPⅨ水平可逐漸升高[5]。研究[6]表明，HBV或許影響肝細胞內PPⅨ代謝和血紅素合成，而PPⅨ與HBV相關慢性肝病進展的關系及其能否用于肝損傷的早期預警及病情評估鮮有報道。

本研究利用HPLC法，高效、高靈敏的檢測了對照組和慢性肝病患者的血清PPⅨ。結果顯示，在HBV感染者疾病進程的不同階段均存在PPⅨ表達異常。與對照組相比，肝病患者的PPⅨ顯著升高，這與以往的研究結果一致[7-9]，也驗證了該方法的有效性。Nakano等[10]研究發現，HCV核心蛋白可以增加貓白血病病毒C亞類受體1(feline leukemia virus subgroup C receptor 1, FLVCR1)和藥物轉運體ATP結合盒G家族成員2(ATP-binding cassette subfamily G member 2, ABCG2)的mRNA表達，降低ATP結合盒B家族成員6(ATP-binding cassette subfamily B member 6, ABCB6)的mRNA表達，HBV核心蛋白同樣如此[6]。FLVCR1是轉運蛋白促進因子超家族成員，可以輸出血紅素和PPⅨ[11]；ABCG2主要定位于細胞外膜和線粒體膜，負責PPⅨ的外排；而ABCB6是線粒體卟啉攝取所必需的[12]，其表達水平直接影響細胞內的PPⅨ濃度[13]。HBV感染者血清中PPⅨ升高可能是HBV核心蛋白通過增加卟啉轉運體FLVCR1和 ABCG2的表達，降低ABCB6的表達，使PPⅨ從肝細胞輸出增加，輸入減少，導致血漿中PPⅨ水平升高。同時，HBV可引起線粒體功能障礙和氧化應激[6,14]，導致血紅素合成障礙和PPⅨ的蓄積，造成肝細胞損害。血紅素合成減少負反饋引起卟啉合成限速酶氨基 γ 酮戊酸合成酶1的增加，又加速了PPⅨ的合成。肝細胞損害也使PPⅨ的清除能力下降，肝腸循環增加，導致血清中PPⅨ水平進一步升高。

PPⅨ增減與肝病輕重，特別是肝損傷程度密切相關[7]，血清PPⅨ還可能與慢性肝病進展呈活動度依賴性，CHB患者活動期與靜止期PPⅨ相比差異無統計學意義，可能與納入CHB患者肝損傷普遍較輕及樣本量較小有關。與代償期LC患者相比，失代償期患者肝功能嚴重受損，PPⅨ水平也顯著升高，說明PPⅨ檢測不但能反映肝損傷，還能幫助判斷病情進展情況。本研究發現HCC患者PPⅨ較CHB、LC患者均顯著增加，說明HCC時卟啉代謝紊亂較慢性肝病更為突出。線粒體功能障礙已被認為是癌癥的標志[15]，肝癌患者PPⅨ顯著升高可能是因為線粒體功能障礙引起氧化應激從而干擾卟啉代謝和血紅素的生成。也有學者[9]認為可能是惡性腫瘤刺激機體卟啉代謝的某個限速酶，使其活性增強，產生大量PPⅨ超過了機體對其的利用，導致血中PPⅨ水平顯著升高。

研究[7,16]證實HBV感染者PPⅨ水平與肝病進展相關，但目前僅有一項研究[9]調查了PPⅨ在HCC患者中的診斷價值，PPⅨ能否作為CHB、LC和HCC鑒別診斷的潛在標志物，目前尚未闡明。本研究通過ROC曲線分析顯示，當PPⅨ取最佳臨界值20.325、33.695、65.26 ng/dl時，采用PPⅨ診斷CHB、LC和HCC的敏感度均在85%以上，特異度均在60%以上，說明PPⅨ對HBV相關慢性肝病診斷的敏感度較高，但特異度特差，因此PPⅨ不具備診斷價值。進一步對靜止期CHB患者和對照組的PPⅨ水平和肝功能指標進行分析發現，靜止期CHB患者肝功能指標與對照組相比，無明顯變化，而PPⅨ水平顯著高于健康對照組，提示PPⅨ是肝損傷的早期事件。在慢性HBV感染時，HBV最早損傷肝細胞線粒體，作為PPⅨ代謝的主要細胞器，線粒體的損傷影響了PPⅨ的正常代謝，此時肝細胞的其他亞細胞器未損傷，表現為膽紅素、轉氨酶等反映肝損傷的指標均正常，而血清PPⅨ異常。因此PPⅨ是反映肝臟早期輕微損傷的敏感指標，具有作為HBV肝損傷的早期預警潛質，可能用于急性、活動性、慢加急性肝損傷或肝衰竭等的預警、轉歸及預后評估。

Spearman相關性分析表明PPⅨ水平可能與肝功能障礙和膽汁淤積的程度有關，這與國外學者的報道相一致[8,17]。HBV損傷肝細胞，使膽紅素和PPⅨ攝取、代謝和排泄能力降低，血清中膽紅素和PPⅨ水平升高。血清中的PPⅨ既有游離態的，又存在和蛋白質結合形式的，血清白蛋白能夠作為PPⅨ的載體參與物質轉運[18]。卟啉轉運蛋白FLVCR1輸出血紅素受到細胞外血紅素結合蛋白和Alb的嚴格控制，在缺乏載體蛋白的情況下FLVCR不能輸出血紅素[11]。本研究LC和HCC組PPⅨ顯著升高，可能與患者Alb合成減少，輸出血紅素亦減少導致PPⅨ的蓄積有關，也說明PPⅨ可作為肝損傷的評估指標。本研究發現HBV感染者PPⅨ不與ALT、AST呈顯著的相關性，這可能與ALT、AST僅在肝細胞出現明顯炎癥及壞死時才升高有關，也可能是反映肝損傷的不同發病機理或不同分子通路。

綜上所述，HBV相關慢性肝病患者血清PPⅨ顯著升高，且與慢性肝病進展呈活動度依賴性，可作為肝損傷的早期預警和病情評估的潛在臨床指標，對評價肝損傷程度、判斷肝臟儲備功能、協助慢性肝病診治具有一定的臨床意義。同時，由于本研究樣本量較小和樣本的局限性，其結果推廣應用有待進一步研究。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：張瓔、成若晨負責課題設計，資料分析，撰寫論文；郭蕊、王霞參與收集數據與樣本檢測；劉凱歌負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。