滅活酵母培養物對育肥羔羊瘤胃發酵和細菌群落及免疫指標的影響

曹文新，李艷琴，紀守坤，嚴 慧，段春輝，郭云霞，劉月琴，張英杰，王 康，尹雪姣

（河北農業大學動物科技學院，河北保定 071000）

羔羊育肥周期短、效益好，是我國畜牧業的朝陽產業[1]。目前，對于集約化飼養的育肥羔羊來說，高精料日糧成為一種典型的營養策略，但飼喂高精料在提高生長性能的同時，也會發生腹瀉、瘤胃酸中毒等營養性疾病[2]。隨著養羊業的不斷發展，飼料添加劑的應用逐漸廣泛。酵母培養物（Yeast Culture，YC）作為一種新型飼料添加劑，其含有大量的代謝產物、酵母細胞壁及培養基成分，可以改變瘤胃微生物群落，調節瘤胃內環境，提高動物免疫與抗氧化能力，從而提高生長性能，已被廣泛應用于奶牛和肉牛養殖中[3-5]，對反芻動物的高效生產及機體健康具有重要意義。關于YC 在羔羊育肥中應用，Opsi 等[6]研究發現，高精料日糧中添加滅活釀酒酵母對pH 和總揮發性脂肪酸無顯著影響，但對乙酸、丙酸、丁酸和戊酸影響顯著。閆佰鵬等[7]研究發現，在不同淀粉來源（精粗比6.5:3.5）育肥湖羊日糧中添加1%活性YC 對瘤胃發酵參數無顯著影響。目前，關于YC 在不同日糧結構下對育肥羔羊瘤胃pH 和揮發性脂肪酸（VFA）的影響的研究較多，滅活酵母培養物不同添加量對高精料條件下羔羊瘤胃發酵及免疫抗氧化性能的研究鮮有報道。因此，本試驗旨在研究高精料羔羊育肥條件下不同水平的滅活酵母培養物對羔羊瘤胃發酵、瘤胃細菌多樣性、抗氧化和免疫性能的影響，為YC 在育肥羔羊日糧的利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 滅活酵母培養物由德國萊博有限公司提供，其營養成分：粗蛋白質≥24%，粗脂肪≥3.2%，粗纖維≥11%，粗灰分≤6.4%，賴氨酸≥1.6%，蘇氨酸≥1.2%，蛋氨酸≥0.4%。

1.2 試驗設計與日糧 選擇體重（35.65±1.84）kg 的3.5月齡健康公羔（杜泊和湖羊雜交F1）80 只，隨機分為4 組，每組5 個重復，每個重復4 只羊。在飼喂基礎飼糧的同時分別添加滅活酵母培養物 0（CON 組）、5（YCL 組）、10（YCM 組）、15g/（只d）（YCH 組），預試期7 d，正試期60 d。

基礎飼糧的配制參考NRC（2007）[8]推薦的35kg羔羊日增重300g 營養需要量確定日糧營養水平，配方組成見表1，以全混合日糧（TMR）形式飼喂。

表1 試驗飼糧組成及營養成分(干物質基礎)

1.3 飼養管理 試驗前圈舍用具消毒，試驗羊打耳號，并進行相關免疫及驅蟲處理，每天08:00 和15:00 飼喂，自由飲水。為使試驗羊采食到設計量YC，先將各組YC 與少量TMR 料混勻，使試驗羊采食完畢，其余TMR 料自由采食。每天早晨飼喂前打掃圈舍，保障環境清潔衛生。

1.4 樣品采集與處理

1.4.1 瘤胃液采集與處理 試驗第60 天，每組隨機選取10 只羊（每個重復2 只羊），晨飼前，口腔插管采集瘤胃液6 mL，立即測定pH；采集2 mL 分裝到凍存管中，液氮保存，備測微生物區系；另取4 mL 濾液，10 000 ×g 離心10 min，移取1.5 mL 上清液至無菌離心管中，加0.15 mL 25%偏磷酸，渦流混合器搖勻，靜置30 min，10 000×g 離心15 min，取上清液-20℃保存，用于測定VFA。

1.4.2 血液樣品的采集與處理 試驗第60 天，每組隨機選取10只羊（每個重復2只羊）于晨飼前頸靜脈無菌采血，置于5 mL 促凝管中，離心機3 000×g 離心10 min。將離心好的血清分裝到1.5 mL 無菌離心管中，置于-20℃冰箱保存，用于測定免疫及抗氧化指標。

1.5 指標測定及方法

1.5.1 瘤胃液pH 和VFA 濃度的測定 使用Sartorius PB-10型pH 計測定瘤胃液pH。采用外標法利用Agilent-7890A氣相色譜儀（美國Agilent Technologies）測定瘤胃液VFA 濃度[9]。

1.5.2 瘤胃微生物測定分析 瘤胃液高通量測序，參照DNA Kit（Omega Bio-tek,Norcross,GA，U.S.）試 劑盒說明書提取樣本DNA，用細菌16s rDNA V3-V4 區引物擴增PCR，利用IlluminaMiseq PE300 高通量測序平臺測序。下機數據經過QIIME（v1.8.0）軟件過濾、拼接、去除嵌合體，去除低質量序列[10]。根據barcodes歸類各處理組序列信息，物種分類的OTU（Operational Taxonomic Units）序列相似性設置為97%。對比silva數據庫，得到每個OTU 對應的物種分類信息[11]。再利用Mothur 軟件（version 1.3.1.2）進行α多樣性分析。基于Jaccard 距離，使用R（v3.1.1）軟件進行β多樣性分析[12-13]。

1.5.3 免疫及抗氧化指標測定 采用酶聯免疫分析法（ELISA）測定[14]血清中免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、α干擾素（IFN-α）、白介素6（IL-6）以及總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA），試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.6 統計分析 所有數據利用Excel（2007）進行初步整理，然后利用SPSS21.0 進行Duncan's 法多重比較，并對滅活酵母培養物添加水平進行線性和二次分析，瘤胃細菌的分析通過R 軟件Vegan（3.3.2）包進行。數據均以平均數±標準差的形式表示，統計顯著性水平為P<0.05，具有顯著性趨勢為0.05

2 結果

2.1 滅活酵母培養物對羔羊瘤胃液pH 及VFA 的影響 由表2 可知，pH 在各組間差異不顯著，隨著滅活酵母培養物添加量增加，乙酸濃度呈先降低后升高的二次曲線變化（P<0.05），YCH 組丙酸、TVFA 濃度較YCM 組和CON 組升高（P<0.05），并存在線性和二次增加（P<0.05），丁酸濃度呈一次線性增加（P<0.05），各組乙酸、丙酸及丁酸的摩爾比例和乙酸/丙酸比差異不顯著。

2.2 滅活酵母培養物對羔羊瘤胃細菌多樣性的影響

2.2.1 不同滅活酵母培養物添加量對羔羊瘤胃細菌α多樣性的影響 由圖1 可以看出，各試驗組覆蓋率（Good Coverage）均在0.99 以上，表明測序深度能夠真實反映瘤胃微生物群落。各組間Chao1 指數、觀測到的物種數（Observed Species）、香農指數（Shannon）、辛普森指數（Simpson）和PD 值均無顯著差異。

2.2.2 不同滅活酵母培養物添加量對羔羊瘤胃細菌菌群豐度的影響 由表3 可知，在門水平上，厚壁菌門和擬桿菌門是各組試驗羊瘤胃內優勢菌群；YCH 組擬桿菌門豐度顯著高于CON 組和YCL 組，呈線性顯著升高；纖維桿菌門線性增加，厚壁菌門、變形菌門、螺旋體門和軟壁菌門豐度在各試驗組間無顯著差異。

表2 不同滅活酵母培養物添加量對羔羊瘤胃液pH 及VFA 的影響

圖1 不同滅活酵母培養物添加量對羔羊瘤胃細菌α 多樣性的影響

由表4 可知，在屬水平上，各組試驗羊瘤胃中普氏菌屬為優勢菌。普氏菌屬1、克里斯滕森菌、毛螺菌屬、月形單胞菌屬豐度各組間均無顯著差異（P>0.05）；YCH 組和YCL 組理研菌屬豐度顯著低于CON 組和YCM 組（P<0.05）；瘤胃菌屬豐度隨滅活酵母培養物添加量的增加呈一次線性增加（P<0.05）。

2.2.3 不同滅活酵母培養物添加量對羔羊瘤胃細菌β多樣性的影響 由圖2 可知，基于Jaccard 距離的PCoA 分析顯示，橫坐標的貢獻率為68.3%，縱坐標貢獻率為23.8%，兩坐標軸共解釋了不同細菌群落差異的92.1%，YCH 組與CON 組組間菌群結構差異顯著（ANOSIM，P<0.05），其他組間差異不顯著（ANOSIM，P>0.05）。

2.3 滅活酵母培養物對羔羊機體抗氧化能力的影響 由表5 可知，YCH 和YCL 組T-AOC 濃度顯著高于CON和YCM 組；YCL、YCM、YCH 組SOD 活性顯著高于CON 組，并存在線性和二次增加（P<0.05）；YCH 組MDA 含量顯著低于CON 組；各試驗組間GSH-Px 含量差異不顯著。

2.4 滅活酵母培養物對羔羊機體免疫指標的影響 由表6 可知，YCM 和YCH 組IgM、IgG、IgA 含量顯著高于CON 組；隨著滅活酵母培養物添加量的增加，IgM、IgG 含量線性增加（P<0.05）；各組間IFN-α、IL-6 含量無顯著差異。

3 討 論

3.1 滅活酵母培養物對羔羊pH 及VFA 的影響 pH 是評價羔羊瘤胃健康的重要直觀因素。高精料日糧容易降低瘤胃pH，影響營養物質的消化與吸收[15]。本試驗中，添加滅活酵母培養物后，盡管統計上未達到顯著水平，但可以看到添加滅活酵母培養物一定程度提高了瘤胃pH，與周傳社等[16]在湘東黑山羊添加YC 的結果一致。目前，就YC 在高精料條件下能否對瘤胃pH 造成影響，研究結果并不一致。Lascano 等[17]研究發現，在荷斯坦奶牛高精料日糧中添加YC，發現YC 有穩定瘤胃pH的功能；郭永清等[18]研究結果表明，日糧中添加活性YC 組斷奶犢牛pH 較未添加組未發生顯著變化。向洋[19]和Liu 等[20]分別在奶牛和綿羊高精料日糧中添加無活性YC，發現未對瘤胃pH 產生顯著影響。前人研究推測，添加滅活酵母培養物后，瘤胃pH 未發生顯著變化，可能是滅活酵母培養物含有的氨基酸、肽、維生素和有機酸等營養物質可以刺激瘤胃內乳酸利用菌的生長，從而將過多的乳酸轉變為短鏈脂肪酸，減少乳酸在瘤胃內的蓄積，起到穩定瘤胃pH 的作用[16,20]。本試驗中，盡管羔羊采食高精料日糧，各組瘤胃液pH 均較高，推測可能與瘤胃液采集于晨飼前，非結構性碳水化物已得到充分消化，瘤胃pH 較穩定有關。

表3 不同滅活酵母培養物添加量對羔羊瘤胃細菌菌群組成的影響（門水平） %

表4 不同滅活酵母培養物添加量對羔羊瘤胃細菌菌群組成的影響（屬水平） %

圖2 基于Jaccard 距離的PCoA 分析

表5 不同滅活酵母培養物添加量對羔羊機體抗氧化能力的影響

表6 不同滅活酵母培養物添加量對羔羊免疫指標的影響

瘤胃VFA 的含量和組成是評價反芻動物瘤胃發酵能力的直接指標。反芻動物60%的消化能由VFA 提供，而乙酸、丙酸、丁酸約占VFA 含量的95%[20]。YC 可以提高瘤胃發酵過程中VFA 濃度[4,21-23]。本試驗中，添加滅活酵母培養物后，乙酸呈二次曲線變化、丁酸線性顯著增加、YCH 組丙酸和TVFA 含量較CON 組顯著增加，說明滅活酵母培養物能夠提高VFA 含量。滅活酵母培養物可以提高VFA 含量，一方面可能是滅活酵母培養物含有的氨基酸、肽類、有機酸等代謝產物增加了高精料日糧下羔羊唾液的分泌，促進了瘤胃發酵機能，從而改善了淀粉等的利用[15,21-23]；另一方面可能是滅活酵母培養物穩定了瘤胃pH，減少了高精料條件下乳酸在瘤胃的蓄積，為微生物的生長提供了適宜的環境，保障了羔羊瘤胃正常發酵[21]。本試驗中，YCM 組乙酸、丙酸含量較YCL 和YCH 組低，可能是由動物個體差異引起，具體原因需進一步研究。

3.2 滅活酵母培養物對羔羊瘤胃細菌多樣性的影響 反芻動物瘤胃微生物種類復雜，數量龐大，每克瘤胃食糜中約含1011個細菌，是一個相對穩定的生態系統[24]，因此常使用α多樣性和β多樣性反映群落內物種多樣性和群落間物種相似性[25]。本試驗添加滅活酵母培養物后，瘤胃細菌α多樣性未產生顯著差異，但瘤胃微生物群落結構發生顯著變化，與樸光赫[21]研究結果一致。這可能是試驗所用滅活酵母培養物經過低溫滅活，雖然不含活性酵母細胞，但其中的氨基酸、脂類、肽、酶、有機酸、寡糖、維生素以及未知生長因子等可以選擇性調控瘤胃特定微生物生長，從而影響瘤胃微生物群落結構[26]。

在門水平上，大量研究表明，厚壁菌門和擬桿菌門是反芻動物瘤胃優勢菌群[27]。擬桿菌能夠協助宿主降解非纖維物質（蛋白質和多糖），促進該類物質的消化吸收，纖維桿菌門可以分解纖維素使動物能夠消化吸收[28]。甄玉國等[29]研究表明，YC 組綿羊瘤胃擬桿菌門相對豐度高于未添加組。本試驗中，YCH 組擬桿菌門的相對豐度顯著高于CON 組，纖維桿菌門豐度隨滅活酵母培養物添加量的增加線性增加。高精料日糧中，淀粉含量高，擬桿菌能夠降解多糖，而滅活酵母培養物可以穩定瘤胃pH，防止高精料日糧造成的瘤胃內環境改變，為擬桿菌和纖維桿菌的生長繁殖提供適宜環境。

在屬水平上，本研究發現，各試驗組普氏菌屬均占主要地位，當滅活酵母培養物添加量為15g/（只d）時，普氏菌屬和月形單胞菌屬相對豐度有所增加，YCH 組和YCL 組理研菌屬相對豐度顯著低于YCM 組和CON組，同時隨著滅活酵母培養物添加量的增加，瘤胃菌屬相對豐度線性增加。普氏菌屬和瘤胃菌屬可分解纖維生成乙酸，這2 種菌屬相對豐度的增加有利于瘤胃中乙酸的生成；理研菌屬屬于一種有害菌，與短鏈脂肪酸的產生有關；月形單胞菌屬和少數瘤胃菌屬均可參與瘤胃丙酸的生成。本試驗發現，添加滅活酵母培養物組月形單胞菌屬豐度有所增加。Jiang[30]在泌乳牛日糧中添加滅活酵母培養物亦增加了月形單胞菌屬的豐度。高精料日糧能夠促進上述微生物的增殖，導致丙酸的生成增多[31]，這與本試驗丙酸增加的結果相對應，同時滅活酵母培養物可促進乳酸利用菌增殖從而發揮穩定瘤胃pH 的作用，為纖維分解菌、乙酸和丙酸生成菌的增殖提供了適宜的環境[31]。

3.3 滅活酵母培養物對羔羊機體抗氧化性能的影響T-AOC、GSH-Px、SOD、MDA 是反映機體抗氧化能力的主要指標[32]。本試驗中，滅活酵母培養物添加量為15g/（只d）時，顯著提高了羔羊血清中T-AOC 和SOD活性，降低了MDA 含量。YC 可以提高機體抗氧化性能，如王衛正[33]研究發現在奶牛日糧中添加3%YC 后血清SOD 活性極顯著提高，T-AOC 顯著提高；張愛忠[34]在絨山羊高精料日糧中添加YC，發現血清T-AOC 和SOD 活性顯著提高，MDA 含量顯著降低，GSH-Px 活性有所提高。滅活酵母培養物在生產過程中會釋放大量代謝產物以及酵母細胞壁成分，包括豐富的維生素（維生素C、維生素E、β-胡蘿卜素等）、寡糖、酶、谷胱甘肽及未知生長因子，維生素C、維生素E 及β-胡蘿卜素等均可不同程度清除自由基，提高機體抗氧化能力[34]。同時，滅活酵母培養物中含有GSH，可以提高肉羊體內GSH 濃度，GSH-Px 可以利用GSH 作為還原劑促進過氧化氫、有機氫過氧化物和脂質過氧化物的還原，保護細胞免受抗氧化損傷[32,34]。另外，滅活酵母培養物能夠改善瘤胃內環境，促進瘤胃發酵，從側面反映了其對動物抗氧化能力的影響[34]。本試驗中，YCM 組的T-AOC和GSH-Px 含量較YCH 組和YCL 組低，可能是由動物個體差異引起，具體原因需進一步研究。

3.4 滅活酵母培養物對羔羊機體免疫功能的影響 免疫球蛋白是由漿細胞產生，并且具有抗體活性的蛋白質，具有抗細菌、抗病毒、抗外毒素和激活補體的功能[35]。本試驗中，滅活酵母培養物顯著提高了羔羊血清中IgM、IgG 和IgA 含量，免疫球蛋白含量升高說明滅活酵母培養物可以提高機體免疫能力，發揮作用的可能是滅活酵母培養物中含有的甘露寡糖和β-葡聚糖，它們具有激活機體特異性和非特異性免疫的作用[36]。王蘭惠[36]試驗表明，在綿羊瘤胃灌注滅活酵母培養物后21 d，血清中IgG 含量極顯著升高，IgA 含量顯著升高。張愛忠[34]研究發現，YC 可以顯著提高血清IgA 含量，IgG 含量增加，但無顯著差異。另外，滅活酵母培養物中含有小肽、氨基酸、有機酸和一些未知生長因子等豐富的代謝產物，這些代謝產物可以促進營養物質的消化與吸收，參與機體營養代謝活動，從而提高機體免疫功能[37]。

細胞因子是由免疫細胞及相關細胞產生的一類多功能蛋白質多肽分子，包括白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子、集落刺激因子等，可發揮免疫調節抗病毒介導炎癥反應和造血等多種生物學功能，其中IL-6 在炎癥反應中發揮重要作用，IFN-α具有抗病毒作用[35]。前人研究表明，高精料日糧下，瘤胃中氨基酸和糖代謝發生改變，提高了脂多糖在肝臟的蓄積，促使血液中促炎因子、急性期蛋白濃度迅速升高，滅活酵母培養物中含有的甘露寡糖、有機酸和氨基酸等代謝產物可能會降低腸道脂多糖含量，從而降低炎癥反應，提高機體免疫功能[38]。但本試驗結果顯示，添加滅活酵母培養物后，血清中IL-6和IFN-α含量均未發生顯著變化，這可能與本試驗日糧并未引起炎癥反應有關。

4 結 論

本試驗結果表明，滅活酵母培養物添加量為15g/（只d）時，淀粉和纖維分解相關細菌的相對豐度升高，瘤胃微生物群落結構發生改變，VFA 產量顯著增加，促進了瘤胃發酵，同時提高了羔羊免疫及抗氧化性能。