褪黑素對動物繁殖的調控作用機制研究進展

梁錦萍，字向東

（西南民族大學動物科學國家民委重點實驗室，四川成都 610041）

褪黑素（Melatonin，MLT）因可以使兩棲類動物皮膚色澤變淺而得名，最早是從牛的松果腺提取得到，所以也稱為松果腺素。除松果體外，胃[1]、卵巢[2]等組織器官也能分泌少量褪黑素。褪黑素在動物機體中參與許多生理過程，作用廣泛，如調節胃腸道運動[1]、抗腫瘤作用[3-4]、抗氧化[5]、延緩卵巢衰老[6]、增強免疫力[7]以及調節動物生殖機能[8-10]。本文綜述了褪黑素對動物季節性繁殖、卵泡發育、精子發生、體外受精、早期胚胎發育和精液冷凍保存的作用及其作用機制，旨在為畜牧生產實踐中褪黑素的使用提供參考。

1 褪黑素概述

1.1 褪黑素的化學性質 褪黑素分子結構為N– 乙酰基–5– 甲氧基色胺，是一種色氨酸衍生物，分子量為232 的吲哚類神經內分泌激素[11]，是微溶于水、易溶于乙醇等有機溶劑的淡白色結晶[12]。

1.2 褪黑素的合成代謝 褪黑素主要由松果腺合成分泌，視交叉上核（Suprachiasmatic Nucleus，SCN）接收外界的光周期信號之后，傳入松果腺，從而調節褪黑素的分泌[13]。褪黑素的分泌節律表現為明顯的晝夜性和季節性，主要受到光照的周期調控，此外也會受到光色、光照強度、溫度、動物種類等因素影響[14]。褪黑素分泌的晝夜節律表現為白晝低夜晚高，延長光照會顯著降低血清褪黑素水平，而縮短光照則會顯著提升血清褪黑素水平。不同的物種、品種之間以及同一品種不同生理時期的褪黑素分泌也存在差異[15-16]。

早期研究認為，褪黑素只能由松果腺合成分泌，后來的研究證明動物體內多種組織器官，如胃、卵巢、胎盤、腦、心、肝等也具有分泌褪黑素的功能[1-2,16-20]，但只有松果腺與視網膜能夠進行周期性分泌[13]。褪黑素在動物體內的合成是由5-羥色胺通過芳基烷胺N-乙酰基轉移酶（Action of Arylalkylamine N-acetyltransferase，AANAT）和乙酰5-羥色胺一氧甲基轉移酶（Acetylserotonin O-methyltransferase，ASMT）也稱羥吲哚一氧甲基轉移酶的順序作用合成[19]。褪黑素在體內經肝臟降解，細胞色素P450 酶的亞型對褪黑素進行6-羥基化，產生6-羥基褪黑素，進一步催化褪黑素中的氧進行去甲基化，得到去N-乙酰-血清素（N-乙酰-5-羥色胺），最后被硫酸化或者葡萄糖醛酸化，其代謝產物隨尿液排出[21]。

1.3 褪黑素受體 褪黑素受體1（Melatonin Receptor 1，MT1）和褪黑素受體2（Melatonin Receptor 2，MT2）是褪黑素的2 種亞膜型受體，存在于多種動物中，均屬于G 蛋白偶聯受體家族。而褪黑素受體3（Melatonin Receptor 3，MT3）是一種胞質酶-醌還原酶2，與MT1、MT2 并不相似，與褪黑素的結合能力更弱。除此之外，褪黑素還具有核受體，即維甲酸Z 受體/維甲酸相關孤核受體（RZR/ROR）超家族的孤兒核受體，通過核受體途徑也能完成褪黑素的某些生物功能[18]。

MT1、MT2基因在成年母豬的腦、卵巢、腎臟、心臟等器官以及脂肪等組織中均有表達，并且在卵巢和腦組織中的表達顯著高于其他器官組織[22]。也有研究發現，MT1基因在藏綿羊整個發情周期的下丘腦、垂體、卵巢以及輸卵管和子宮中均有表達[23-24]。還有研究發現MT1 和MT2 在妊娠奶山羊卵巢[25-26]表達，在人的乳房、卵巢、子宮和胎盤[16]以及嚙齒動物腹股溝和附睪脂肪細胞、人類白色脂肪組織和棕色脂肪組織中都有表達[27]。

2 褪黑素與動物的季節性發情調控

動物的季節性繁殖是其長久以來適應環境，使后代在最適宜的季節中出生，更好地生長發育而形成的一種節律性生活特征。光照是引起動物季節性繁殖的重要因素之一，而光照的周期變化會引起動物體內褪黑素的周期性變化。褪黑素能參與多種動物的繁殖調控，特別是季節性繁殖動物。季節性繁殖的動物可以分為長日照型（馬、驢、貓等）和短日照型（綿羊、山羊、鹿等）[14]。長日照型高原鼠兔的腦和血清中的褪黑素水平在非繁殖期極顯著高于繁殖期[28]。褪黑素能夠降低家貓促黃體素（Luteinizing Hormone，LH）水平，補充外源性褪黑素可以有效抑制母貓卵巢的活性，因此可以通過注射褪黑素給家貓避孕[29]。而短日照型動物則相反，體內埋植褪黑素可以提高非發情季節的母鹿體內的卵泡刺激 素（Follicle Stimulating Hormone，FSH）和LH 濃度，促進其卵泡發育、發情排卵[30]。褪黑素在下丘腦-垂 體-性腺軸（Hypothalamus Pituitary Gonad Axis，HPGA）上可以調節下丘腦分泌的促性腺素釋放激素（Gonadotropin Releasing Hormone，GnRH）的分泌，但是在不同物種上的作用表現不同[31-32]，褪黑素也能直接影響由垂體前葉合成和分泌FSH、LH 及其受體的表達[30,33]。綜上所述，褪黑素對季節性繁殖的調控在不同物種之間存在差異，對長日照動物來說是抑制因子；對短日照動物來說是促進因子[34]。

研究發現，視網膜接收季節性光照光信號的變化后通過SCN 傳遞到松果腺從而調節褪黑素的分泌[13]。褪黑素作用于MT1，并通過促甲狀腺激素（Thyroidstimulating Hormone，TSH）-TSH 受體（TSHR）信號通路調節和2 型甲狀腺素脫碘酶（Type 2 Iodothyronine Deiodinase，DIO2）和DIO3 的表達和轉換，最終通過甲狀腺素（Thyroid Hormone，TH）作用于HPGA，調控哺乳動物的季節性繁殖活動[34-35]。除了通過上述的TH調控通路外，褪黑素還有可能靶向親吻素（Kisspeptin，Kp）和RF酰胺相關肽（RF Amide-related Peptide，RFRP）調節GnRH 神經元的活力，影響GnRH 的分泌，參與動物的季節性繁殖調控[36]。在HPGA 中，褪黑素與促性腺激素抑制激素（Gonadotropin-inhibitory Hormone，GnIH）對動物繁殖活動的調控具有協同作用，但褪黑素如何影響GnIH、在整個繁殖活動中兩者作用之間的關系仍有待進一步研究[37]。

3 褪黑素對雌性動物生殖機能的調控

3.1 褪黑素對卵巢的調控作用 通過100 μmol/L 褪黑素處理能夠顯著增加體外培養的小鼠卵泡中雄激素和孕酮的產生[38]。褪黑素是通過調節大鼠類固醇合成基因（CYP17A1）的表達來影響卵泡類固醇的產生[39]。而褪黑素可以影響體外培養的豬顆粒細胞增殖和類固醇生成[40]。褪黑激素通過下丘腦-垂體-性腺軸調節FSH及LH 的分泌進而影響性腺生殖激素的分泌；也可以通過血液直接作用于卵巢褪黑素受體調控類固醇性激素分泌[41]。MT1基因敲除小鼠的褪黑素信號通路阻斷，導致瘦素水平降低、類固醇激素分泌減少和產仔數減少。補充瘦素可以改善MT1基因敲除小鼠的排卵，恢復類固醇激素水平[27]。豬瘦素缺失不影響褪黑素的合成，但會降低產仔數和類固醇激素，可以認為瘦素是褪黑素調控小鼠和豬雌性生殖的下游靶點[27]。

卵巢的衰老主要表現在卵巢卵泡和卵母細胞數目的減少，具有正常染色體分布的卵母細胞百分比降低，體外受精后原核形成的持續時間變長以及卵母細胞發育潛力下降。褪黑素處理組雌性ICR 小鼠在10～43 周齡只飲用含褪黑素的水（100 μg/mL），其原始卵泡、初級卵泡和竇狀卵泡以及卵母細胞數量都多于對照組[42]。在昆明小鼠上的研究發現，褪黑素可以延緩卵巢衰老導致的卵母細胞數量下降，減少因衰老引起的閉鎖卵泡數量，但是并不能完全阻止卵泡消失[6]。

活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）導致氧化應激，損傷卵泡內的卵母細胞和顆粒細胞[43]。已有研究發現，褪黑素在牛卵巢發揮抗氧化作用，降低卵巢的氧化應激[44]；保護人類顆粒細胞[45]和卵母細胞免受氧化應激的損傷[46]；減少小鼠卵泡顆粒細胞的細胞核、線粒體和質膜中毒氧化應激[47]。

3.2 褪黑素對卵泡發育的調控 神經內分泌、旁分泌和自分泌調控著卵泡的生長發育。褪黑素可以通過局部的旁分泌和自分泌影響卵泡生長發育[18]，也能夠通過影響其他性腺激素的合成與分泌從而調節卵泡的生長發育。體內埋植褪黑素可以加快山羊優勢卵泡的生長，從而提高卵泡的發育能力[48]。此外，褪黑素的抗氧化和抗細胞凋亡作用也能保護卵泡在生長發育過程中免受ROS 等氧化物質的損傷。健康卵泡顆粒細胞中褪黑素受體MT1 和MT2 表達顯著高于閉鎖卵泡[22]，說明褪黑素及其受體可能在卵泡發育與閉鎖調控中發揮著重要作用。

3.3 褪黑素對卵母細胞體外成熟的影響 卵母細胞體外成熟（In vitromaturation，IVM）已成為現代胚胎生物技術的重要內容之一，是體外受精（IVF）、核移植（Nuclear Transfer，NT）等生物技術的重要環節。褪黑素除了對體內的卵母細胞有益作用外，對卵母細胞體外成熟也能發揮作用。褪黑素（10-7mol/L）通過清除ROS 和調節類固醇激素的產生，顯著促進豬卵母細胞的體外成熟，并且可以保護線粒體，使豬卵母細胞免受熱應激損傷[49]。褪黑素（10-9mol/L）可以顯著降低玻璃化冷凍的牛卵母細胞的ROS 水平，抑制細胞凋亡，從而增加其發育潛力[10]。

褪黑素促進人卵母細胞成熟的抗氧化作用是通過增強網格蛋白介導的內吞作用（Clathrin-mediated Endocytosis，CME）來實現的，其表現為包被核和囊泡數量的增加，同時用于組裝核和囊泡的主要蛋白表達上調[50]。在牛卵母細胞IVM 中，褪黑素通過去甲基化來調節基因和蛋白的表達[51]。這些發現揭示了褪黑素在IVM 過程中改善卵母細胞質量的潛在機制。此外，應用褪黑素可以減少百草枯（Paraquat，PQ）對牛卵母細胞的損傷，顯著減輕PQ 對IVM 卵母細胞的毒性作用[52]。以上結果證明，褪黑素可以促進卵母細胞的成熟，并且減少卵母細胞的氧化應激損傷，在卵母細胞IVM中發揮重要作用[53]。

4 褪黑素對雄性動物的生殖機能調控

4.1 褪黑素對精子發生的調控 睪丸間質細胞對精子的發生具有重要作用。褪黑素能夠提高小鼠睪丸間質細胞活力[54]，抑制細胞凋亡，從而調控精子發生。連續注射褪黑素拮抗劑，能夠誘導非繁殖時期的高原鼠兔恢復其生殖細胞發育和精子發生，可以認為褪黑素節律性分泌可以介導調控高原鼠兔季節性精子發生[55]。在體外培養條件下，10-7mol/L 的褪黑素能顯著促進薩福克羊的精原細胞分化為功能性單倍體精子細胞[56]；同時，褪黑素受體普遍存在于精子發生的各級細胞中，且在動物受精階段表達水平最高[57]。這些研究證明褪黑素及其受體參與調控精子發生過程以及體外生精細胞單倍體發育。

4.2 褪黑素對精子質量的影響 高內源性褪黑素濃度可以提高人精子質量，短期體外的褪黑素處理可改善精子活力[58]；每天補充6 mg 褪黑素可以增加機體褪黑素水平并減少精子DNA 造成的氧化損傷[59]。10-5mol/L 和10-3mol/L 褪黑素可提高細胞質膜完整性、線粒體活性和頂體完整性，顯著降低細胞內ROS 水平，在牛精子獲能過程中發揮抗氧化性能，改善獲能后的精液品質，有助于提高受精率和體外胚胎發育[60]。褪黑素能夠延長常溫保存的豬精液的有效存活時間[61]。在豬精液稀釋液中添加一定量的褪黑素可以有效緩解熱應激引起的精子質量下降，但對精子活率并沒有顯著影響[62]。羊精液低溫保存條件下添加適宜濃度褪黑素（20 mg/L）能夠提高精子品質，但褪黑素濃度過高（≥80 mg/L）保存效果反而下降[63]。0.003 mmol/L 褪黑素對雞精液保存有明顯作用，但過高濃度的褪黑素對雞精液保存有抑制作用[64]。0.5 mg/mL 褪黑素能提高絨山羊的精子抗氧化能力以及冷凍保存效果[65]。

5 褪黑素對受精與早期胚胎發育的影響

5.1 褪黑素對受精作用 受精作用的關鍵在于卵母細胞和精子的質量以及精子的獲能。褪黑素可以通過促進卵母細胞的成熟，進一步促進克隆胚胎和體外受精及其早期胚胎發育[53]。從被褪黑素處理過的小鼠體內取出的卵母細胞體的外受精率和囊胚率都有所提高[42]。有研究證明，褪黑素可以通過改善細胞器的正常分布，提高細胞內谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和ATP 水平，增強抗氧化基因表達水平，調節受精相關過程，從而提高牛卵母細胞的受精能力和發育能力[51]。精子獲能是順利完成受精中至關重要的一個環節。精子在體外獲能的過程中會產生高濃度ROS，造成對精子的氧化應激，而褪黑素的抗氧化性質恰好可以減少這種傷害，利于精子的體外獲能以及胚胎的早期發育。褪黑素對精子獲能有直接的調節作用，在低劑量（100 pmol/L）時有激活作用，在高劑量（1 μmol/L）時有抑制作用[66]。

5.2 褪黑素對早期胚胎發育的影響 褪黑素對卵巢、卵母細胞以及精子的作用，都將進一步影響早期胚胎發育。有研究發現，牛孤雌胚胎早期發育中存在褪黑素受體MT1 蛋白的表達，并且MT1 在牛孤雌胚胎發育的各個時期均有表達，并且呈逐漸增多的趨勢[67]，證明褪黑素通過與MT1 結合對牛早期胚胎發育起到重要的調節作用[8]，這在豬和羊等動物中也得到了證實[68]。褪黑素處理（10-3mol/L）牛精子后進行體外培養得到的胚胎的囊胚發育率顯著提高，而囊胚中凋亡細胞核的發生率顯著降低[60]。褪黑素預處理可以抑制PQ 對牛胚胎的氧化損傷，其抗凋亡性有助于穩定細胞內氧化還原狀態從而保護胚胎活性[69]，這說明褪黑激素可以增強牛胚胎在氧化應激條件下的發育潛力。褪黑素還能提高冷凍小鼠2-細胞胚胎的體外發育能力[70]。

6 小 結

褪黑素及其受體在多種動物的多種器官、組織細胞中廣泛存在，并且在機體各個系統中發揮作用，參與調節各種生理活動，如褪黑素參與調控動物的季節性繁殖、影響動物內分泌。雌性動物褪黑素可以延緩卵巢衰老，調節卵泡發育，抵抗氧化應激損傷，促進卵母細胞的成熟。雄性動物褪黑素能調控精子發生，提高精子質量，改善精液品質與提高精液保存的質量。褪黑素在卵母細胞IVM，精液冷凍保存以及精子獲能過程中發揮著重要作用，提高了IVF 能力以及早期胚胎發育的潛能。但不同物種的配子、胚胎所需外源褪黑素的適宜濃度不同，仍然需要進一步研究確立褪黑素對于各種家畜家禽的有效安全的添加濃度。隨著對褪黑素作用機理研究的深入，褪黑素在人工授精、體外受精和胚胎移植等生殖工程領域將發揮更加重要的作用。