內蒙古絨山羊Wnt10b 干擾載體的構建及鑒定

吳子賢，吳 靜，王 榮，周 健，王瑞雪，劉俊陽，劉佳森，趙艷紅*

（1.內蒙古農業大學動物科學學院，內蒙古呼和浩特 010018；2.內蒙古烏蘭察布市商都縣職業技術學校，內蒙古烏蘭察布 013450；3.內蒙古自治區農牧業科學院畜牧研究所，內蒙古呼和浩特 010031）

在眾多動物纖維中，山羊絨因其良好的御寒功能和極好的柔軟親膚性受到廣大消費者喜愛，被譽為“纖維皇后”。隨著消費者對羊絨產品需求量的不斷增加，提高羊絨產量成為研究熱點。內蒙古絨山羊是經過自然選擇和人工選育的優良地方品種，不僅肉質鮮美而且還是異質雙重毛被類型，經濟價值頗高。全球40% 的羊絨產自內蒙古，有“世界羊絨看中國，中國羊絨看內蒙”一說[1-3]。盡管目前內蒙古絨山羊羊絨產量龐大，但有粗毛過多影響絨毛生長的問題，因此在保證絨毛產量的同時提高絨毛質量是亟待解決的問題[4]。

上述問題的解決，離不開對毛囊發育周期及組織結構的深入研究。毛囊分為初級毛囊與次級毛囊，次級毛囊由初級毛囊分化而來[5]，絨山羊毛囊的周期變化一般指次級毛囊的季節性再生過程，一般而言，次級毛囊經歷生長期（4—11 月）、退行期（12 月至次年1 月）、休止期（2—3 月）3 個時期[6]。毛囊生長發育受眾多信號通路調控，其中Wnt 信號通路在毛囊生長發育和分化中起到重要作用[7]。Wnt 分泌蛋白可刺激細胞中多種信號通路，作為生長調節因子影響細胞的增殖、分化以及遷移，許多研究證實經典Wnt/β-catenin信號通路對毛囊生長的決定性作用[8-10]。Wnt10b作為通路中的核心影響因子[11-13]，在小鼠與兔子的表皮中均有大量表達[14-15]，常子麗[16]、王巖[17]等證實Wnt10b在內蒙古絨山羊皮膚中有大量表達，但未有細胞水平驗證Wnt10b功能的研究。本文通過Wnt10b干擾載體的構建以及轉染內蒙古絨山羊耳皮膚細胞對Wnt10b基因的表達進行分析，旨在為后續通路中相關基因表達研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 自內蒙古呼和浩特市土左旗金萊牧業種山羊場選取1 歲齡內蒙古絨山羊，取耳根部組織，常溫保存并快速帶回細胞實驗室清洗和酒精消毒，操作臺中通風剪碎培養元代細胞。

1.2 實驗試劑 DPBS（Hyclone）、0.25%胰酶（Gibco）、高糖培養基DMEM/F12（含丙酮酸鈉，不含hepes、Hyclone）、青霉素和鏈霉素（雙抗，Gibco）、BI 胎牛血清（Biological Industries）、DMSO（日本和光劑）、DNA 內切酶HindIII、BbsI（Peprotech）、無內毒素質粒DNA 提取試劑盒（OMEGA）、總RNA 提取試劑盒（RNAsimple Total RNA Kit，TIANGEN）、熒光定量染料（TB Green Premix Ex Taq II，TaKaRa）、實時定量PCR 試 劑（Taq PCR Mastermix kit，TIANGEN)、反轉錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa）、DNA Maker DL500（TaKaRa）。

1.3 實驗方法

1.3.1 絨山羊Wnt10b基因的克隆 根據NCBI 上的山羊Wnt10b基 因CDS 序 列（XM_018047850.1）使 用Primer Premier 5.0 軟件設計引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列為：F：5'-TGCTCACAAC CGCAACTC-3'；R：5'-GGTCTCGCTCGCAGAAG-3'。合成基因片段使用Taq PCR Mastermix kit（TIANGEN）試劑盒進行PCR 擴增，擴增體系為25 μL：cDNA 1 μL（100 ng/μL），上下游引物各1 μL（0.2 μmol/L），Gree Mix 23 μL（1×）。反應條件：預變性95℃ 5 min，變性95℃ 30 s，退火60℃ 30 s（變性和退火運行30 個循環），延伸72℃ 10 min。

1.3.2 真核表達載體構建 擴增物經退火反應后膠回收并連接到pSGU6-shRNA 模板，引物序列為：，shRNA 模板中的loop 結構選用了TTCAAG AGA（方框內）以避免形成終止信號，shRNA 的轉錄終止序列采用T6 結構。正義鏈模板的5' 端添加了CACC（下劃線），與BbsI 酶切后形成的粘端互補；反義鏈模板的5' 端添加了AGCT（下劃線），與HindIII 酶切后形成的粘端互補；如果siRNA 的第一個堿基不是G，則在CACC 后補加一個G。

1.3.3 產物轉化 對質粒進行測序驗證（上海生工生物工程股份有限公司完成），測序驗證的pSGU6-Wnt10b質粒轉化至感受態細胞，-80℃冰箱中取出大腸桿菌DH5α感受態細胞，冰浴至細胞解凍，加入10 μL 連接產物并混勻繼續冰浴30 min；轉到42℃水浴鍋中90 s；快速放回冰浴中3 min，加入800 μL不含抗生素的LB 液體培養基，蓋嚴離心管，搖床內37℃、220 r/min 細菌復蘇45 min，產物均勻涂抹在含卡那霉素的固體LB 培養基上，置于37℃細菌培養箱中培養16 h。

1.3.4 質粒提取 產物轉化后挑單克隆抗體于200 mL 液體LB 培養基中繼續轉化16 h，所得菌液使用OMEGA無內毒 素質粒提取試劑盒大量提取，操作按說明書逐步完成，所得DNA 要求OD260/OD280在1.8～2.0，且濃度適用于后續實驗步驟，可在-20℃條件下長期保存。

1.3.5 細胞轉染 轉染前24 h 細胞鋪6 孔板，觀察細胞生長至80%左右時，使用Lipofectamine-3000 轉染試劑，按照說明書操作，每孔質粒為5 μg，轉染3 h 后換為含血清的完全培養基，分別在轉染后12、24、48 h 使用倒置顯微鏡觀察細胞轉染熒光情況。

1.3.6 RNA 提取及qRT-PCR 轉染48 h 后使用Trizol將所有細胞提取RNA，后續均使用TaKaRa 公司試劑盒進行反轉錄和實時熒光定量PCR 反應。反轉錄條件為：變性：37℃ 15 min，復性：85℃ 5 s，延伸：4℃。選β-actin 為內參基因，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列見表1，qRT-PCR 使用Applied Biosystems 7500，反應體系為20 μL，反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，39 個循環；95℃變性15 s，60℃退火60 s，95℃延伸15 s。以轉染48 h 的細胞與未轉染的細胞RNA 反轉錄所得cDNA 為模板，利用qRT-PCR 檢測Wnt10b相對表達量，看家基因選為β-actin，其中對照組為未處理細胞。

1.4 統計分析 實驗數據先用Excel 2010 參照2-ΔΔct法計算處理，結果用平均值± 標準誤表示，之后采用SPSS 25.0 軟件中的單因素ANOVA 方差檢驗分析，P<0.01 為差異極顯著，P<0.05 為差異顯著。

表1 基因擴增引物序列表

2 結果與分析

2.1 原代耳皮膚細胞生長狀態 原代耳皮膚細胞在前3 d貼壁速率較慢，前期切忌晃動培養瓶影響貼壁速率，第5 天開始貼壁，第7 天時出現島嶼狀分布生長狀態，第9 天時生長密度達到80%，且呈鵝卵石狀，傳代后第3天為指數生長期，傳至第5 代時細胞增殖速率降低。如圖1 中達到第9 天細胞密度時，可進行細胞傳代。

圖1 原代耳皮膚細胞增殖（×100）

2.2 重組質粒 利用全基因合成法獲得絨山羊Wnt10b基因的CDS 全長片段，經過PCR 擴增，將選取的pSGU6 載體與目的基因進行酶切處理，使用PCR 儀將其結合，最終產物為重組質粒。連接物中加入卡那霉素抗性篩選標記物，載體帶有GFP 綠色熒光標記物，熒光標記有利于后續實驗確認細胞是否轉染成功。所構建的pSGU5-Wnt10b載體線性結構如圖2 所示。

圖2 重組質粒pSGU5-Wnt10b 的線性結構

2.3 細胞轉染 利用脂質體法將質粒轉染至耳皮膚細胞中，在細胞貼壁24 h 后加入混合質粒的轉染試劑，期間避光培養3 h 后換為無轉染試劑的普通培養基，在轉染前12 h，綠色熒光較弱，24 h 后出現形態分布，但細胞形態模糊，48 h 后轉染熒光強度最高，圖3 為轉染48 h 后暗場細胞熒光圖和明場細胞狀態圖，轉染效率達50%以上，處理細胞可用于后續提取RNA。

圖3 pSGU6-Wnt10b 轉染絨山羊皮膚細胞

2.4 實時熒光定量PCR 由圖4 可知，轉染pSGU6-Wnt10b后的細胞與未處理細胞相比Wnt10b基因表達量顯著降低，表明質粒已成功轉染至耳皮膚細胞中，有效降低了Wnt10b基因的表達，可用于后續實驗的研究。

圖4 qRT-PCR 結果

3 討 論

在前人研究成果中，多利用皮膚組織進行體內研究實驗，結果顯示影響毛囊生長的重要通道為Wnt[15]、BMP[17]、FGF[18]等基因通路，在多種動物體內已驗證這些基因的蛋白表達調控毛囊的產生和發育，但在體外培養細胞中尚有部分基因未得到實驗驗證。由于耳皮膚細胞生長力旺盛且易獲得，有助于后續瞬時轉染處理，瞬時轉染因其時效短、效率高等優點被廣泛應用，因此本研究選用內蒙古絨山羊耳皮膚細胞對Wnt10b干擾載體進行驗證。

在Wnt通路中眾多信號相互作用，有研究證明，在皮膚中毛囊的動態形成過程中，Wnt信號在表皮層就已開始作用，在表皮層缺乏Wnt信號的前提下毛乳頭發育不正常，表明Wnt信號通過表皮信號誘導真皮層毛乳頭的形成，其中Wnt10b在毛基板形成中的作用顯著[18]。對小鼠、兔子的研究發現，Wnt10b基因功能失活或表達沉默會導致毛被異常生長的狀況[19]。將Wnt10b添加在小鼠的毛乳頭細胞中，經過100 d 的毛囊發育周期后，硫酸軟骨素蛋白（versican）及淋巴增強因子（Lef-1）等毛囊生長相關基因均顯著性表達[20]，盡管Wnt10b及其信號通路在毛囊發育中的作用研究已取得很大進展，然而仍有一些問題尚未解決，進一步驗證Wnt10b的生物學功能對其在經濟動物生產中的應用具有重要意義。近年來有學者使用免疫組化確定Wnt10b在內蒙古絨山羊皮膚毛囊中蛋白表達位置，通過PCR 檢測毛囊3 個階段中Wnt10b表達量差異[21]，但尚未有在細胞水平使用基因干擾手段驗證該基因在毛囊發育中的作用。對Wnt10b基因進行功能驗證不僅僅是對此基因的研究，同時也對此信號通路中其他基因的研究提供基礎，Wnt10基因表達抑制可能會影響對β-catenin、Lef-1等因子的控制，本研究對內蒙古絨山羊耳皮膚細胞中的Wnt10b基因進行干擾處理，為后續驗證通路中受Wnt10b影響的基因以及個體水平的研究提供合適的供體細胞，為解決內蒙古絨山羊羊絨產量及質量改良的問題提供科學依據。

4 結 論

本研究選用內蒙古絨山羊耳皮膚細胞對Wnt10b干擾載體進行驗證，成功構建載體并將其轉染至細胞內，利用實時熒光PCR 技術驗證細胞中Wnt10b基因表達量，其表達量相對于未處理細胞有極顯著差異，說明pSGU6-Wnt10b干擾載體可有效干擾細胞中基因表達，且成功轉染至細胞中，研究結論為后續研究毛囊生長相關信號通路提供了基礎。