湖羊瘤胃微生物葡聚糖酶基因GH5-47 的原核表達與酶學性質研究

尉俏女，高德英，王佳堃，田 健，李 平，諸 輝，尹尚軍*，王 謙,*

（1.浙江萬里學院生物與環境學院，浙江寧波 315100；2.寧波希諾亞海洋生物科技有限公司，浙江寧波 315700；3.浙江大學動物科學學院奶業科學研究所，浙江杭州 310058）

β-葡聚糖、木聚糖等非淀粉多糖是植物性飼料中重要的抗營養因子，廣泛存在于植物細胞壁中。β-葡聚糖是指β-D-葡萄糖殘基通過β-1，3 和β-1，4-糖苷鍵連接形成的線性多聚糖，主鏈上的葡萄糖糖環數量通常為數百個以上[1]。植物性飼料中的非淀粉多糖（NSPs）在消化道環境中能與水分子相互作用變得黏稠，且多個分子間交聯構成網狀結構進一步增加黏度甚至形成凝膠，導致難以被單胃動物或消化道功能發育不完全的幼齡反芻動物消化、利用，造成飼料轉化率下降和養殖成本上升[2-4]。

飼用酶制劑因綠色、環保、高效等優點成為飼料添加劑領域的研究熱點。糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases，GHs）是降解NSPs 消除其抗營養作用的重要酶類，主要包括β-葡聚糖酶、木聚糖酶等。其中，β-葡聚糖酶能夠水解β-葡聚糖主鏈上的β-1，3 和（或）β-1，4-糖苷鍵生成低聚寡糖或單糖。β-葡聚糖酶作為飼用酶制劑能有效降低植物細胞壁結構、降低消化道內容物黏度、改善腸道形態結構，從而促進動物個體生長和改善生產性能，在畜牧生產中具有重要應用價值[5-6]。本課題組前期采用宏基因組文庫篩選[7]和宏轉錄組測序[8]技術從湖羊瘤胃微生物中獲得了大量碳水化合物活性酶（Carbohydrate-Active Enzymes，CAZymes）基因。本研究進一步克隆、表達β-葡聚糖酶基因GH5-47，分析酶學性質和多底物動力學，為新型酶制劑研發建立基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 湖羊瘤胃微生物總RNA 由本實驗室保存；大腸桿菌表達宿主E.coliBL21（DE3）感受態和EasyScript?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司；表達載體pET-28a（+）購自北京安諾倫北京生物科技有限公司；Super Pfx 聚合酶購自北京康為世紀生物科技有限公司；ClonExpress?II One step Cloning Kit 購自南京 諾唯贊生物科技股份有限公司；卡那霉素（kanamycin，Kan）、標準分子量Marker、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）和Ni-NTA agarose 購自上海生工股份有限公司；質粒提取試劑盒和產物純化試劑盒購自杭州愛思進生物技術有限公司；大麥葡聚糖和苔蘚地衣多糖購自Megazyme 公司，魔芋膠底物購自美國Sigma-Aldrich 公司。

1.2 構 建GH5-47 重組大腸 桿菌利用EasyScript?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 將2 μg 湖羊瘤胃內容物總RNA 反轉錄成cDNA。以稀釋5 倍的cDNA 樣品為模板，利用Super Pfx 聚合酶和GH5-47基因引物進行PCR 擴增（表1）。反應條件：98℃2 min；98℃ 10 s，58℃ 20 s，72℃ 30 s，32 個循環；72℃ 8 min。PCR產品純化后與經BamHI 和EcoRI 雙酶切的pET-28a（+）混 合，利用ClonExpress?II One step Cloning Kit 進 行重組，之后熱激轉化E.coliBL21（DE3）感受態細胞，涂布含100 μg/mL Kan 的LB 平板（0.5% 酵母膏，1%蛋白胨，1% NaCl，2%瓊脂）。37℃培養14～16 h 后，利用載體引物T7-F 和T7-R 進行菌落PCR。挑取陽性菌落轉接至4 mL 含100 μg/mL Kan 的LB 液體培養基。37℃，200 r/min 培養14～16 h 后，提取質粒送至上海生工公司測序。將測序正確的重組菌種命名為BL21/pET28a/GH5-47。

1.3 GH5-47 蛋白誘導表達與純化 從LB 平板上挑取BL21/pET28a/GH5-47單菌落至5 mL 含100 μg/mL Kan 的LB 液體培養基。37℃，200 r/min 培養14～16 h后轉接至1 000 mL 含10 μg/mL Kan 的LB 培養基，37℃，200 r/min 震蕩培養至OD600為0.6～1.0 時（3～4 h），添加終濃度為0.5 mmol/L 的IPTG，16℃，100 r/min 誘導培養14～16 h。10 000 r/min，4℃離心15 min 收集細胞，用200 mL PBS 緩沖液（137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4，pH 7.4）清 洗1 次，10 000 r/min 離心15 min。棄上清，沉淀用100 mL PBS 緩沖液重新懸浮，利用FB-2010 均質機（上海勵途）中破碎10 min（流速6 L/h，壓力810 MPa，6℃）。10 000 r/min，4℃離心15 min，上清液即為重組GH5-47 蛋白粗酶液。之后，按課題組前期建立的方法，利用HisTrapTMFF 柱（GE Health.Bio-Sciences）對GH5-47蛋白進行親和層析[9]。

1.4 SDS-PAGE 與酶譜分析 將40 μL 純化蛋白與20 μL 5×Loading Buffer 混合，煮沸5 min，10 000 r/min，4℃離心5 min。取上清用于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），濃縮膠為4%，分離膠為15%。酶譜分析是在凝膠中加入終濃度為0.5%的多糖底物（葡聚糖、地衣多糖或魔芋膠）。40 μL 純化蛋白與10 μL 5×Native loading Buffer 混合后直接用于電泳。電泳結束后，取出凝膠置于25% 異丙醇中復性3 次，每次20 min。之后，將凝膠在4℃的PBS 緩沖液中漂洗過夜。經0.1%剛果紅染色30 min 后，利用0.5 mol/L NaCl 脫色至出現透明條帶。

1.5 最適反應pH 酶活分析采用3,5 二硝基水楊酸（DNS）法[10]，以0.5% 葡聚糖為反應底物測定GH5-47 對底物的還原糖釋放量。以葡萄糖-OD540 建立標準曲線，計算GH5-47 酶活。1 個酶活性單位（U）是指每分鐘釋放底物生成1 μmoL 還原糖所需的酶量。采用Bradford 法測定蛋白濃度[11]，以BSA-OD595建立標準曲線，計算GH5-47 的蛋白濃度。

將15 μL GH5-47 純酶（約2.5 μg，下同）與60 μL分別用pH 2.2～10.0 緩沖液（檸檬酸/ 磷酸緩沖液pH 2.2～8.0；碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液pH 9.0～10.0 配制的0.5%葡聚糖底物在50℃下反應10 min。同時設置空白對照，對照組中加入15 μL 預先煮沸滅活的酶液，與0.5%葡聚糖反應10 min。分別在試驗和對照體系加入75 μL DNS 試劑，99℃保溫10 min。待冷卻至室溫后利 用SpectraMax M3 酶標儀（Molecular Devices）于540 nm 下測定吸光值。以最高活性時的pH 為100%，計算各pH 條件下相對活性，設置4 組平行試驗。

表1 引物序列

1.6 最適反應溫度 將15 μL GH5-47 純酶與60 μL 0.5%葡聚糖底物混合，分別置于20～70℃，pH 5.0 下反應10 min。按1.5 所述設置對照組。以最適反應溫度下的酶活性為100%，計算各溫度條件下相對活性，設置4組平行試驗。

1.7 pH 穩定性 在最適溫度下，將15 μL GH5-47 純酶分別在30 μL 不同pH 緩沖液（pH 2.2～10.0）中，25℃下孵育1 h。加入30 μL 1%葡聚糖底物在最適條件下反應10 min，按上述條件測定酶活。以未處理的酶活性為100%，計算各pH 條件下的殘余活性，設置4 組平行試驗。

1.8 熱穩定性 在pH5.0 緩沖體系中，將15 μL GH5-47純酶分別在50℃或60℃保溫1 h。在0、2、5、10、20、30、60 min 取樣，分別加入60 μL 0.5%葡聚糖底物，于最適條件下反應10 min，按1.5 條件測定酶活。以未處理的酶活性為100%，計算各溫度條件下的殘余活性，設置4 組平行試驗。

1.9 動力學參數 分別配制0.1～10 mg/mL 的多糖底物（葡聚糖、地衣多糖、魔芋膠、微晶纖維素、刺槐豆及羧甲基纖維素底物），取純酶（約0.03 μg）在pH 5.0、50℃下反應10 min，測定OD540，設置4 組平行試驗。利用GraphPad Prism 8 軟件（San Diego，CA）計算米氏常數（Km）和最大反應速率（Vmax）。

1.10 金屬離子及EDTA 耐受能力 將15 μL GH5-47 純酶與30 μL 不同濃度（0.5～10 mmol/L）的金屬離子（K+、Al3+、Pb2+、Cu2+及Zn2+）或EDTA 混合，4℃孵育1 h后，各試驗管中加入30 μL 1%葡聚糖底物，于pH 5.0、50℃下反應10 min，按上述條件測定酶活。以未處理的酶活性為100%，計算各處理條件下的殘余活性，設置4 組平行試驗。

1.11 統計分析 利用在線工具Compute pI/Mw（https://web.expasy.org/compute_pi/）計算蛋白理論分子量和等電點，利用SignalP-5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測蛋白信號肽，利用Pfam（http://pfam.xfam.org/）分析蛋白功能結構域，利用SWISS-MODEL（https://www.swissmodel.expasy.org/interactive）對蛋白進行同源建模，利用BLASTp（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列相似性比對。系統發育進化樹的構建是在CAZy 數據庫找出相應家族已有結構的酶（http://www.cazy.org/），并在PDB 數據庫（http//www.rcsb.orgl/）中下載目標蛋白的序列文件，之后利用MEGA6.0 軟件下的Neighbor-Joining Tree 方法進行進化樹構建。利用Graphpad Prism 8 繪制圖片，數據統計采用Student’st-test。** 表示P<0.01；*** 表示P<0.001。

2 結果

2.1 葡聚糖酶GH5-47 序列分析 本研究從湖羊瘤胃微生物中擴增得到一個開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）長度為1 098 bp 的葡聚糖酶基因GH5-47，共編碼365 個氨基酸。GH5-47 蛋白理論分子量和等電點分別為40.6 ku 和4.62。Pfam 分析顯示，該蛋白包含1 個GH5 家族催化域結構，但未發現信號肽序列。SWISSMODEL 分析顯示，該蛋白的催化結構域為（β/α）8桶狀結構，屬GH5 家族的典型特征。通過系統發育樹分析可以發現，GH5-47 與硬壁菌門細菌（Firmicutesbacterium ADurb.BinA205）內切葡聚糖酶（GenBank No：OPZ19512）或黃色瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）纖維素酶（GenBank No：WP_109726445 和WP_173322629）聚成一簇（圖1），氨基酸序列相似性分別為71.66%、66.57%和59.73%，而這些蛋白的功能與性質均未被研究。

2.2 GH5-47 重組表達 重組工程菌BL21/pET28a/GH5-47，經0.5 mmol/L IPTG 誘導表達、超聲破碎和Ni-NTA agarose親和層析后，獲得分子量約為43 ku 的GH5-47 重組蛋白（圖2-A），這與其理論分子量和載體序列分子量之和相一致。酶譜試驗進一步發現，重組GH5-47 對大麥葡聚糖、苔蘚地衣多糖和魔芋膠底物均具有降解作用（圖2-B）。

2.3 重組GH5-47 的酶學性質 重組GH5-47 的最適反應pH 為5.0、溫度為50℃（圖3-A 和B）。該蛋白在pH 4.0～6.0 較為穩定，處理1 h 后仍能保持80% 以上活性（圖3-C）；同時，該蛋白在50℃以下較為穩定，處理1 h 后，仍能保持81.81% 的殘余活性。當溫度上升至60℃以上，則活性迅速喪失。在60℃下處理2、10、30 min，重組GH5-47 僅能保持80.68%、64.24%、18.17%的殘余活性（圖3-D）。

2.4 重組GH5-47 多底物動力學分析 利用多種多糖底物分析重組GH5-47 的活性底物譜可以發現，該蛋白能高效催化葡聚糖和地衣多糖，Vmax分別為1111、895.8 μmol/（minmg protein）。此外，重組GH5-47 還對魔芋膠底物具有一定催化能力，Vmax 為15.15 μmol/（minmg protein）。而重組GH5-47 對微晶纖維素、刺槐豆膠和羧甲基纖維素則沒有催化作用（表2）。

圖1 GH5-47 系統進化樹分析

圖2 重組GH5-47 SDS-PAGE 和酶譜分析

2.5 金屬離子和EDTA 對重組GH5-47 活性的影響 分析金屬離子和EDTA 對重組GH5-47 活性的影響可以發現（圖4），重組GH5-47 對K+和EDTA 的耐受能力較強，經0.5～10 mmol/L K+或EDTA 處理1 h 后，仍能保持90% 以上殘余活性（P>0.05）。同時，0.5～1 mmol/L Al3+或0.5 mmol/L Pb2+不影響GH5-47 的催化活 性，但高濃度（5～10 mmol/L）情況下，GH5-47 活性降低（P<0.001）。此外，Cu2+或Zn2+均能抑制GH5-47 的活性（P<0.001）。0.5 mmol/L Zn2+卻能促進GH5-47的催化作用，其原因暫不清楚。

3 討 論

草食動物消化道微生物通常被認為對植物性飼料具有高效降解能力。其中，瘤胃微生物菌群數量極其龐大，每克瘤胃內容物中約包含1011個細菌、104～106個纖毛蟲和102～104個厭氧真菌[12]。這些微生物在反芻動物日糧消化、利用過程中發揮主導作用，直接影響動物生產效率[13-14]。然而，由于瘤胃等動物消化道環境較為特殊，采用常規純培養技術很難獲取這類極端環境微生物。目前，僅有少數纖維降解菌等瘤胃微生物通過亨氏滾管[15-16]、厭氧培養箱和選擇性分離培養基[17]分離獲得。近年來，隨著高通量測序技術和生物信息學的發展，研究人員采用多組學分析技術從奶牛[18]、湖羊[10]、駱駝[19]等反芻動物的瘤胃或腸道微生物中篩選獲得大量的潛在CAZymes 基因。由于候選CAZymes 基因數量龐大，且部分基因存在序列不完整或信息缺失等情況，其中僅少數功能酶的性質得到研究。

前期本課題組采用宏轉錄組學技術在湖羊瘤胃微生物中發現15 個GHs 家族共2 151 個潛在CAZymes基因序列，并研究了與纖維素降解相關的GH5 家族中的Cel5A-h11 和Cel5A-28 的基本酶學性質[8]。本研究通過系統發育進化樹、BLAST 等序列分析發現，該CAZymes 基因資源庫中的葡聚糖酶GH5-47 催化結構域為GH5 家族典型的（β/α）8桶狀結構，氨基酸序列與已報道的內切葡聚糖酶相似度較低。除硬壁菌門細菌ADurb.BinA205 內切葡聚糖酶（GenBank No:OPZ19512）外，絕大多數序列均來自黃色瘤胃球菌（GenBank No:WP_109726445 和WP_173322629），但氨基酸序列一致性均低于72%，推測GH5-47 為一種新型內切葡聚糖酶。

圖3 重組GH5-47 的基本酶學性質

表2 重組GH5-47 多底物動力學分析（n=4）

圖4 金屬離子和EDTA 對重組GH5-47 活性的影響

本研究進一步克隆并表征了該CAZymes 基因資源庫中的葡聚糖酶GH5-47，發現該酶對葡聚糖、地衣多糖底物發揮高效降解作用，并具備一定的魔芋膠底物催化作用。由于葡聚糖是大麥等谷物類植物細胞壁中的主要NSPs 之一，表明該酶對谷物類飼料具有較強降解、利用能力，進一步提示從反芻動物消化道中篩選飼用酶制劑是一種良好的策略[20]。酶學性質分析表明，GH5-47 重組蛋白的最適反應溫度為50℃，在50℃以下活性較為穩定，而在60℃以上活性迅速下降。這與前期從瘤胃微生物中分離的纖維素酶[10]、木聚糖酶[20-21]等CAZymes 的熱穩定性不佳相一致，推測這與反芻動物瘤胃內（38～41℃）環境相適應的結果。然而，飼用酶制劑在實際應用中通常需要制備成顆粒飼料，GH5-47蛋白雖然酶活性較高，但在制粒工藝（通常80℃以上）中會完全喪失活性。因此，為滿足工業化生產和應用的需求，可以采用基因工程、酶工程技術進一步改造或修飾GH5-47 提示其熱穩定性[22-25]。

4 結 論

本研究從湖羊瘤胃微生物中克隆了葡聚糖酶基因GH5-47，在大腸桿菌中進行異源表達。GH5-47 重組蛋白在pH4.0～6.0 較為穩定，最適反應pH 為5.0；在50℃以下較為穩定，最適反應溫度為50℃；對0.5～10 mmol/L K+或EDTA、0.5～1 mmol/L Al3+或0.5 mmol/L Pb2+表現較強耐受能力；GH5-47 對葡聚糖、地衣多糖和魔芋膠均具有催化作用，可用于后續新型飼用酶制劑的研發。