好食脈孢菌與紅酵母協(xié)同發(fā)酵醋糟的營養(yǎng)價值研究

高 佳，項斌偉，陳書明*，辛嘉英，張建新，王倩倩，衛(wèi) 陽，陳亞偉

（1.山西農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，山西太谷 030801；2.右玉縣畜牧局，山西右玉 037200；3.山西農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，山西太谷 030801）

醋糟是釀醋產(chǎn)業(yè)的下腳料，僅山西省每年的排放量就超過60 萬t，全國每年排放量達200 萬t 以上。醋糟作為非常規(guī)飼料，其粗纖維（CF）含量高，粗蛋白質（CP）含量低，營養(yǎng)價值低，適口性差，飼用效果不佳[1]。目前，研究者們多通過微生物發(fā)酵提高醋糟的利用率。張建新等[2]研究表明，利用擔子菌和酵母菌混合發(fā)酵的醋糟中CP 含量顯著增加，CF 含量顯著降低。Wang 等[3]發(fā)現(xiàn)，在蛋雞日糧中添加無花果曲霉發(fā)酵醋糟產(chǎn)物可改善蛋黃顏色，減少蛋雞排泄物中磷含量。好食脈孢菌（Neurospora sitophila）是經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）認證的可用于食品加工的安全菌種，對培養(yǎng)基營養(yǎng)要求簡單，繁殖能力強[4-5]。鄧永平等[5]研究發(fā)現(xiàn)，好食脈孢菌發(fā)酵過程可產(chǎn)生木聚糖酶。劉慈等[4]研究表明，醋糟經(jīng)好食脈孢菌發(fā)酵產(chǎn)生了80.9 mg/kg 類胡蘿卜素，CP 與真蛋白（TP）含量均顯著升高，但升高的蛋白質為好食脈孢菌菌體及孢子蛋白質，瘤胃有效降解率較低。張林等[1]研究表明，紅酵母（Rhodotorula）發(fā)酵醋糟產(chǎn)生的類胡蘿卜素含量僅為6.60 mg/kg，但醋糟CP 和TP 含量顯著提高，且增加量為易于消化吸收的酵母菌體蛋白質?；诖耍狙芯渴紫仍诖自闩囵B(yǎng)基中接種高產(chǎn)類胡蘿卜素的好食脈孢菌，測定發(fā)酵過程中木聚糖酶和纖維素酶的動態(tài)變化及發(fā)酵底物還原糖等營養(yǎng)成分的含量變化；并在上述發(fā)酵產(chǎn)物中接種嗜好還原糖的紅酵母，研究上述2 種菌協(xié)同發(fā)酵醋糟營養(yǎng)價值的變化，為醋糟的無害化處理以及富含優(yōu)質蛋白質的類胡蘿卜素功能飼料的研發(fā)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 紅酵母與好食脈孢菌由山西農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院發(fā)酵實驗室保存，醋糟由山西省太谷縣太平莊醋廠提供。

1.2 好食脈孢菌培養(yǎng)基與種子液制備 好食脈孢菌固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基的配制方法參照文獻[6]。好食脈孢菌種子液的制備：將PDA 固體培養(yǎng)基上的好食脈孢菌接種于液體種子培養(yǎng)基中，于30℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h，調整好食脈孢菌細胞數(shù)為1.4×106個/mL，即為好食脈孢菌種子液。

1.3 紅酵母培養(yǎng)基與種子液制備 紅酵母斜面培養(yǎng)基及液體種子培養(yǎng)基的配制方法參照文獻[6]。紅酵母種子液的制備：將紅酵母斜面培養(yǎng)基上的紅酵母接種于液體種子培養(yǎng)基，于30℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h，調整紅酵母細胞數(shù)達8.5×106個/mL，即得紅酵母種子液。

1.4 試驗設計及過程

1.4.1 好食脈孢菌發(fā)酵醋糟 稱取干醋糟混合物12 份，每份100 g，分別放入12 個燒杯，各加蒸餾水140 mL，高壓滅菌30 min，冷卻至室溫。然后，隨機取9 個燒杯做為試驗組，分別接入好食脈孢菌種子液8 mL，在30℃培養(yǎng)箱發(fā)酵96 h，測定發(fā)酵過程中木聚糖酶和纖維素酶的動態(tài)變化及該發(fā)酵所致發(fā)酵底物中干物質（DM）、CF、酸性洗滌纖維（ADF）、中性洗滌纖維（NDF）、半纖維素、粗灰分（Ash）、CP、TP、粗脂肪（EE）、還原糖、總糖及類胡蘿卜素含量的變化。另外3 個燒杯做為對照組，分別接入經(jīng)過高壓滅菌的好食脈孢菌種子液8 mL，其他處理與試驗組相同。

1.4.2 好食脈孢菌和紅酵母協(xié)同發(fā)酵醋糟 隨機取6 份醋糟好食脈孢菌發(fā)酵產(chǎn)物，并隨機分為2 組，分別為對照組與試驗組。試驗組分別接入紅酵母種子液8 mL，30℃發(fā)酵96 h，然后分別測定該發(fā)酵所致發(fā)酵底物中DM、CF、ADF、NDF、半纖維素、Ash、CP、TP、EE、還原糖、總糖及類胡蘿卜素含量的變化。對照組分別接入高壓滅活的紅酵母種子液8 mL，其他處理與試驗組相同。

1.4.3 纖維素酶及木聚糖酶活性的測定 采用DNS 法測定纖維素酶及木聚糖酶的酶活[7]。

1.4.4 營養(yǎng)成分含量的測定 所有樣品均65℃烘干至恒重，回潮48 h，再進行營養(yǎng)成分測定。DM 測定參照張麗英[7]的方法，CF、ADF、NDF 采用濾袋法測定[7]，半纖維素=NDF－ADF，采用《食品中灰分的測定》（GB 5009.4-2010）測定樣品中的Ash 含量，采用《飼料中粗蛋白測定方法》（GB/T 6432-94）測定樣品中CP 和TP 含量，采用《飼料中粗脂肪的測定》（GB/T 6433-2006）測定樣品中EE 含量，采用DNS 法測定樣品還原糖及總糖含量[8]，利用王蓉等[9]方法測定樣品中類胡蘿卜素含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析 用SPSS 25.0 對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析、Duncan's 多重比較和獨立樣本t檢驗，結果用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 醋糟發(fā)酵過程觀察 由圖1 可知，好食脈孢菌發(fā)酵24 h，醋糟培養(yǎng)基中尤其是培養(yǎng)基表面會出現(xiàn)大量灰白色菌絲；發(fā)酵48 h，培養(yǎng)基中菌絲增多，且培養(yǎng)基表面出現(xiàn)少許黃色好食脈孢菌孢子；發(fā)酵72 h，培養(yǎng)基中出現(xiàn)大量黃色好食脈孢菌孢子，且表面分布較多；發(fā)酵96 h，黃色孢子層加厚，顏色加深。

圖1 好食脈孢菌發(fā)酵醋糟的變化

由圖2 可見，在醋糟好食脈孢菌發(fā)酵產(chǎn)物中接入紅酵母種子液，發(fā)酵24 h，可見培養(yǎng)基表面出現(xiàn)少量淺粉色菌苔；隨著發(fā)酵時間的延長，培養(yǎng)基表面出現(xiàn)紅酵母菌苔顏色逐漸加深，發(fā)酵96 h 時菌苔呈現(xiàn)橙色，表明紅酵母在醋糟培養(yǎng)基中發(fā)酵。

圖2 紅酵母與好食脈孢菌協(xié)同發(fā)酵醋糟結果

2.2 好食脈孢菌發(fā)酵醋糟產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶活性動態(tài)變化 由表1 可知，好食脈孢菌發(fā)酵醋糟產(chǎn)纖維素酶及木聚糖酶活性均呈先升高后降低的趨勢；其中發(fā)酵72 h 時，產(chǎn)纖維素酶活性達到最大值，為17.2 U/g；發(fā)酵48 h 時，產(chǎn)木聚糖酶活性達到最大值，為106.3 U/g。

表1 好食脈孢菌發(fā)酵醋糟產(chǎn)纖維素酶及木聚糖酶活性動態(tài)變化 U/g

2.3 醋糟發(fā)酵前后營養(yǎng)成分含量變化 由表2 可知，好食脈孢菌發(fā)酵及好食脈孢菌和紅酵母協(xié)同發(fā)酵使發(fā)酵底物重量均極顯著降低（P<0.01）。由表3 可知，與對照組相比，好食脈孢菌發(fā)酵醋糟CP 含量、TP 含量、還原糖含量分別提高了23.08%、26.43%、88.24%（P<0.01）；EE 含量、總糖含量分別降低了55.41%、29.66%（P<0.01）；尤其是類胡蘿卜素含量較對照組提高了27.6 倍。與對照組相比，好食脈孢菌與紅酵母協(xié)同發(fā)酵使醋糟CP 含量、TP 含量、類胡蘿卜素含量分別提高了9.68%、11.70%、12.83%（P<0.01）；EE 含量、還原糖含量、總糖含量分別降低了13.33%、52.94%、20.21%（P<0.01）；Ash 含量升高了5.41%（P<0.05）。

3 討 論

宋增廷[10]對山西省4 個地區(qū)12 個釀醋企業(yè)的17個醋糟樣品進行了常規(guī)營養(yǎng)成分分析，結果表明醋糟的NDF、ADF 和木質素的含量分別達到74.98%、52.51%和21.62%，醋糟中CP 平均含量為12.38%，18 種氨基酸均值為9.32%，有機酸平均含量達2 273.96 mg/kg，還含有少量磷、鈉、鉀等礦物質元素，表明醋糟有被開發(fā)利用的價值。

紅酵母菌體蛋白質是優(yōu)質飼料蛋白質，紅酵母發(fā)酵還可產(chǎn)生具有促進動物生長、抗氧化、提高機體免疫力、改善動物繁殖機能等作用的類胡蘿卜素，紅酵母是生產(chǎn)功能性生物飼料常用菌種之一[11-12]。劉夢楊等[13]對紅酵母菌粉進行了安全性評價，結果顯示紅酵母無毒性、無致染色體突變等，可減少小鼠腹部脂肪積累。紅酵母是嗜還原糖酵母菌，醋糟中還原糖含量很低，醋糟中的殘留淀粉不易被紅酵母直接吸收利用[14-15]。紅酵母發(fā)酵醋糟所產(chǎn)生的功能性物質（類胡蘿卜素）較少，僅為6.60 mg/kg[1]，利用紅酵母發(fā)酵豆腐渣酸解產(chǎn)物，其類胡蘿卜素產(chǎn)量為2.65 mg/kg[16]。

好食脈孢菌發(fā)酵可產(chǎn)生多種酶、蛋白質及大量類胡蘿卜素，但產(chǎn)生的蛋白質為好食脈孢菌菌體及孢子蛋白質，動物不易消化吸收。為提高醋糟發(fā)酵產(chǎn)物中的優(yōu)質蛋白質含量，同時提高類胡蘿卜素產(chǎn)量，本研究擬定先進行好食脈孢菌發(fā)酵醋糟，以醋糟中蘊含的大量CF 為誘導物，誘導好食脈孢菌產(chǎn)生纖維素酶和木聚糖酶，進而酶解醋糟中部分CF，提高醋糟中還原糖含量。然后，再利用嗜還原糖的紅酵母發(fā)酵富含還原糖的醋糟好食脈孢菌發(fā)酵產(chǎn)物，以提高醋糟發(fā)酵產(chǎn)物中酵母菌體蛋白質含量。本研究結果顯示，好食脈孢菌發(fā)酵醋糟所產(chǎn)纖維素酶活性于發(fā)酵72 h 時達到最高值，為17.2 U/g，所產(chǎn)木聚糖酶活性于發(fā)酵48 h 時達到最高值，為106.3 U/g，在上述酶的共同作用下，發(fā)酵產(chǎn)物中還原糖含量提高了88.24%，其機理可能是好食脈孢菌發(fā)酵醋糟過程中產(chǎn)生的纖維素酶將纖維素分解成葡萄糖，產(chǎn)生的木聚糖酶將木聚糖降解成木糖和低聚糖[17-21]。第一階段發(fā)酵（好食脈孢菌發(fā)酵醋糟）產(chǎn)生了高達80.1 mg/kg 的類胡蘿卜素，其含量較對照組提高了27.6 倍；第二階段發(fā)酵（好食脈孢菌與紅酵母協(xié)同發(fā)酵）不僅使醋糟發(fā)酵產(chǎn)物中CP含量與TP 含量分別提高了9.68%與11.70%，而且使類胡蘿卜素產(chǎn)量又提高了12.83%。理論上講，好食脈孢菌與紅酵母協(xié)同發(fā)酵提高的蛋白質主要是動物易于利用的酵母菌體蛋白質，而協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)生的類胡蘿卜素又具有抗氧化、提高機體免疫力、改善動物繁殖機能等多種作用[22]。但后續(xù)仍需對本研究獲得的富含蛋白質與類胡蘿卜素的發(fā)酵醋糟進行動物飼養(yǎng)試驗來驗證其飼喂效果。

表2 醋糟樣品發(fā)酵前后重量分析 g

表3 發(fā)酵醋糟樣品營養(yǎng)成分含量分析

4 結 論

好食脈孢菌發(fā)酵醋糟可產(chǎn)生大量類胡蘿卜素，還能產(chǎn)生一定量纖維素酶和木聚糖酶，而這些酶作用于醋糟中的CF，可使醋糟發(fā)酵產(chǎn)物中還原糖含量顯著升高，而后者又為紅酵母發(fā)酵提供了偏好碳源，從而導致好食脈孢菌與紅酵母協(xié)同發(fā)酵醋糟中蛋白質含量、類胡蘿卜素含量進一步提高。