布舍瑞林在奶牛同期發情-定時輸精中的應用效果分析

顧文源，蘇碩青，劉 玉，馮春濤，藺惠良，余文莉,3,4*，李樹靜,3,4*

（1.石家莊天泉良種奶牛有限公司，河北石家莊 050200；2.河北省動物疫病預防控制中心，河北石家莊 050053；3.河北省奶牛良種繁育工程技術研究中心，河北石家莊 050200；4.河北省牛產業技術研究院，河北石家莊 050200）

定時輸精（TimEd Artifical InsEmination，TAI）是根據家畜的繁殖和調控規律，利用外源激素對母畜批量處理，使母畜的發情、排卵具有可控性和一致性[1]，以確保每頭符合條件的奶牛都能在理想的產后間隔內受精。Ovsynch 是第一個廣泛使用的奶牛定時輸精程序[2]，其主要使用促性腺激素釋放激素（GnRH）和氯前列烯醇鈉（PG）2 種激素，通過調控卵巢發育使處于不同發育階段的卵泡達到同時排卵的效果，可直接進行人工授精[3]。采用同期排卵和定時輸精程序可提高高產泌乳奶牛首次配種的參配率和每次人工授精的受胎率[4]。

在集中管理的高產奶牛群中，高產奶量與行為發情表現呈負相關，這表明無論是否檢測發情，定時輸精都可作為同步方案的一部分。輸精前注射PGF2α和GnRH 或其類似物可對黃體和卵泡進行調控，從而實現同步排卵[5]。在美國至少有5 種GnRH 類似物的產品應用于奶牛同期發情-定時輸精[2]。布舍瑞林（Buserelin）是GnRH的人工合成類似物，作為一種新的激素藥品應用于同期發情處理，其作用于垂體，調控機理與GnRH 相同；布舍瑞林活性強，半衰期比GnRH 長。因布舍瑞林促黃體生成激素的能力強于促卵泡激素的釋放，又被稱為黃體生成素釋放激素[6-7]。本研究通過分析布舍瑞林對試驗奶牛生殖激素濃度、卵泡發育合格率及受胎率的影響，評估其在奶牛同期發情-定時輸精中的應用效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 實驗動物為177 頭14～15 月齡、頭胎產后（53±3）d 子宮復舊良好的荷斯坦泌乳牛。

1.1.2 試劑 凍精為進口荷斯坦奶牛冷凍精液。GnRH 的生產批號為B200601，規格為100 μg；布舍瑞林主要成分為促性腺激素釋放激素改造的多肽，批號為190601，規格為40 μg；PG 生產批號為1911008，規格為0.322 mg。3 種試驗藥品均購自寧波三生生物科技有限公司。所用激素類藥品均在有效期內，按使用說明貯存。

1.1.3 主要儀器、設備 輸精槍（蔣氏動物用品有限公司）、臺式離心機（型號為SC-04，購自安徽中科中佳科學儀器有限公司）、獸用B 超儀（型號HS-101V，Honda ElEctronics Co Ltd）、輸精硬外套和軟外套、一次性5 mL 注射器、采血針、含有促凝劑的真空采血管、15 mL 離心管。

1.2 實驗方法

1.2.1 同期發情-定時輸精、采血及血清生殖激素測定實驗Ⅰ：隨機選擇21 頭產后（53±3）d 的荷斯坦泌乳牛，分為陰性對照組、藥物對照組和試驗組。所有試驗動物均采用Ovsynch（079）同期發情-定時輸精方案，方案見表1。陰性對照組用10 mL 生理鹽水處理，藥物對照組用100 μg GnRH 處理，布舍瑞林組用20 μg 布舍瑞林處理，在第2 次注射布舍瑞林/GnRH/生理鹽水后，在24 h 內，每隔2 h 按照無菌采集的標準在牛頸靜脈部位用75%酒精棉球進行消毒，用無菌采血針采集5 mL 血液到含有促凝劑的真空管中，5 000 g×離心15 min，在超凈工作臺中吸取血清于無菌離心管，在-20℃條件下密封保存[2]，將血清送到北京萊博泰瑞科技發展有限公司，通過放射免疫分析法檢測血清中促卵泡激素（FSH）、促黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（P4）激素濃度。

1.2.2 同期發情-定時輸精、卵泡分級、受胎檢查方法實驗Ⅱ：隨機選擇40 頭產后（53±3）d 的荷斯坦泌乳牛，布舍瑞林組分別用10、20 μg 布舍瑞林處理，對照組用100 μg GnRH 處理。所有試驗動物均采用Ovsynch（079）同期發情-定時輸精方案，見表1。在第9 天注射藥物后16～18 h 利用獸用B 超儀檢測卵泡發育情況，直徑1.0～2.5 cm 的卵泡為合格卵泡，大于2.5 cm 的卵泡定為卵泡囊腫，無卵泡和卵泡囊腫定為無排卵。對卵泡質量合格的牛進行輸精（n=40 頭），或模擬生產流程不經檢測直接輸精（n=116 頭）。人工授精后第30 天利用B 超儀檢測牛的受胎情況（P/AI）。

1.2.3 布舍瑞林對荷斯坦奶牛定時輸精的效果分析 依據實驗Ⅱ結果，選擇116 頭產后（53±3）d 子宮復舊良好的泌乳荷斯坦牛分成布舍瑞林組和GnRH 組，按表1方案進行處理，所有同期發情處理牛不進行發情觀察和卵巢檢查，直接進行定時輸精。在人工授精后第30 天用獸用B 超儀檢測受胎頭數。

1.3 統計分析 均值數據采用SPSS 20 軟件單因素方差分析，百分率采用χ2檢驗進行分析。P<0.01 表示差異極顯著，P<0.05 表示差異顯著，P>0.05 表示差異不顯著。

2 結果

2.1 布舍瑞林對荷斯坦奶牛體內生殖激素水平的影響分析 由圖1 可見，在相同的采血時間點，3 組間FSH、LH、P4的濃度均無顯著差異；而生理鹽水組在24 h 的E2濃度顯著高于GnRH 組和布舍瑞林組，其他2 組間差異不顯著。

在不同的采血時間點，3 組FSH、LH、E2、P4激素存在一定差異。GnRH 組4 h 時的FSH 濃度顯著高于22 h 和24 h，6 h 顯著高于22 h；而生理鹽水組內和布舍瑞林組內各采血時間點的濃度值均無顯著差異。GnRH組和布舍瑞林組均在第2 次注射后4 h 時FSH 達到最高濃度，而生理鹽水組的FSH 在16 h 達到最高濃度。

生理鹽水組22 h 時的LH 濃度極顯著高于0～18 h，24 h 顯著高于0、2、8、12 h；GnRH 組22 h 的LH 濃度極顯著高于2、4、12 h，顯著高于0、6、8、10、14、16、18 h；布舍瑞林組20 h 極顯著高于4、6、8、10 h，顯著高于0、2、12、14、16、22、24 h，22 h 顯著高于4、6、10 h，24 h 顯著高于4、6、8、10 h。布舍瑞林組LH 濃度達到最高峰值比生理鹽水組和GnRH組提前了2 h。

表1 同期發情-定時輸精方案

各組內各采血時間點E2濃度之間差異均不顯著。GnRH 組0、2、4、8 h 時的P4濃度極顯著低于14 h，6 h 顯著低于14 h，0、4 h 顯著低于20 h，4 h 顯著低于22 h；布舍瑞林組0、2、8 h 顯著低于18 h；生理鹽水組內各采血時點的濃度值均無顯著差異。布舍瑞林組在第2 次注射后0 h，即PG 注射后48 h，E2達到最高濃度，P4達到最低濃度，而生理鹽水組和GnRH 組分別延遲24 h/4 h 和10 h/4 h（E2/P4）。

圖1 外源激素處理后母牛血清中FSH、LH、E2、P4的濃度變化

2.2 不同布舍瑞林劑量對荷斯坦泌乳牛同期發情處理的效果分析如表2 所示，10 μg 布舍瑞林組、20 μg 布舍瑞林組和GnRH 組的無排卵率無顯著差異；20 μg 布舍瑞林組受胎率顯著高于10 μg 布舍瑞林組，其他各組差異不顯著。

表2 布舍瑞林不同劑量及GnRH 處理對奶牛同期發情定時輸精效果的影響

2.3 布舍瑞林對荷斯坦奶牛定時輸精的效果分析 如表3 所示，在檢測卵泡和不檢測直接輸精的情況下，布舍瑞林20 μg 組受胎率略高于GnRH 組（P>0.05）。

表3 布舍瑞林對奶牛受胎率的影響

3 討 論

母畜在正常的發情到排卵之間，FSH、LH、E2、P4濃度會發生一系列密切關聯的消長變化。理論上，在基于GnRH 的同期發情定時輸精方案中，第1 次注射GnRH（GnRH1）后將釋放LH，使優勢卵泡排卵，并使卵泡發育波同步，卵泡發育的同步波產生排卵卵泡。第2 次注射GnRH（GnRH2）是在注射PG 后進行的，目的是釋放LH，并使GnRH1 處理產生的優勢卵泡排卵[2]。張賀[8]研究發現，注射GnRH 外源激素不僅引起血漿中LH 水平明顯升高，FSH 水平也明顯升高。本研究中，GnRH 組和布舍瑞林組均在第2 次注射后4 h 時FSH 達到最高濃度，而生理鹽水組的FSH 在16 h 達到最高濃度，3 組內的FSH 最低濃度與LH 最高濃度均同時出現，但布舍瑞林組均比其他2 組提前2 h（20 h vs 22 h）。

多項研究表明，在Ovsynch 程序中，GnRH1 排卵可改善情期受胎率，原因在其第1 次注射GnRH 后間接促進了母牛體內LH 和FSH 的釋放，再通過注射PG 溶解發情周期的黃體，縮短黃體周期，牛群集中進入下一個發情周期，再進行第2 次注射GnRH 既能維持卵巢中卵泡的數量，又能促進黃體發育，進而改善了情期受胎率，但對在GnRH1 缺乏功能性黃體的奶牛來說這種影響受到限制[9-10]。第1 次注射GnRH 的排卵反應取決于使用GnRH 時的發情周期階段，在發情周期的第5～9 天奶牛排卵率最高，并確保在排卵卵泡發育期間P4濃度升高[10]。血漿P4水平為0.5 ng/mL 的奶牛被認為是“同步的”[11]。注射PG 會使功能黃體消溶[12]，黃體退化使LH 脈沖頻率增加，優勢卵泡增加其生長迅速并產生較高濃度的E2，E2對下丘腦-垂體軸起正反饋作用，導致LH 激增，出現LH 峰，隨后促進排卵，形成黃體[13]。Masoumi 等[14]研究發現，注射PG 后48 h 血中P4濃度未降至0.5 ng/mL時，懷孕的可能性將顯著降低。Nowicki 等[15]研究發現，在GnRH2 處理后P4濃度高（P4>1ng/mL）比P4濃度低（P4<0.5ng/mL）的奶牛妊娠率低，妊娠損失高。正常生理狀態下，母牛外周血漿中P4含量在發情時最低（<1 ng/mL），E2含量最高（15～25 Pg/mL）[16-18]。定時輸精在GnRH2 處理后16～18 h 進行，排卵發生在GnRH2 處理后24 h 內[11]。本實驗中，布舍瑞林組在第2 次注射后0 h，即PG 注射后48 h，E2達到最高濃度，P4達到最低，而生理鹽水組和GnRH 組分別延遲24 h/4 h 和10 h/4 h（E2/P4）；3 組血中P4濃度均低于0.5 ng/mL，生理鹽水組在24 h 時的E2濃度顯著高于GnRH 組和布舍瑞林組，其他2 組差異不顯著。本研究表明，布舍瑞林第二次注射后0 h，P4和E2濃度的關聯性變化，與正常生理狀態下母牛發情時兩激素濃度的關聯性變化比GnRH 更一致，生理鹽水組母牛的排卵時間可能遲于其他2 組。本研究布舍瑞林組LH 峰值比GnRH 組提前2 h 出現，是否2 組奶牛的發情時間有所不同，有待進一步研究。

Bamber 等[19]研究顯示，初產和經產牛產后50～65 d 無排卵發生率分別為29.6%和19.1%。本研究中，在產后（53±3）d，10 μg 和20 μg 布舍瑞林組及GnRH 組的奶牛無排卵發生率分別是14.3%、27.3%和6.7%。Pursley 等[20]用Ovsynch 程序在奶牛場獲得的受胎率（P/AI）與觀察發情后人工授精的受胎率相似（39% vs 37%）；Poock 等[2]的研究中采用Ovsynch 方案，母牛產后首次授精受胎率為38.8%，夏季授精的母牛受胎率低于冬季授精的母牛。Ricci 等[4]研究表明，實施Ovsynch 方案后的荷斯坦母牛受胎率在19.8%～33.0%。在基于Ovsynch 的程序中，GnRH 產品對首配奶牛的受胎率沒有影響[2]。本研究中，在檢測卵泡和不檢測直接輸精的情況下，20 μg 布舍瑞林組的受胎率略高于GnRH 組。

4 結 論

本實驗條件下，20 μg 布舍瑞林可安全、有效地用于奶牛同期發情-定時輸精程序。