牛卵巢卵泡Smad9 表達模式的研究

郭翔宇，賈凱琪，韓 琦，馬曉燕，黨文慶，王 鍇，李雅婷，李鵬飛，呂麗華*

（1.山西農業大學動物科學學院，山西太谷 030801；2.山西農業大學生命科學學院，山西太谷 030801）

哺乳動物卵巢卵泡從早期腔前卵泡到成熟卵泡的發育受不同內源性因素的調節，其中，BMP/Smad 信號通路在其發育的不同階段發揮了不可替代的作用[1-8]。Smads 蛋白（Smad1-9）在TGF-β家族的轉錄調節過程中起重要作用[9-11]，細胞外的BMPs 配體激活細胞上的I 型和II 型受體，并激活Smads 蛋白將細胞外信號傳遞到細胞核中，并且每一個Smads 蛋白在信號傳遞過程中起不同的作用[12-13]。按功能作用不同，Smads 分為受體激活型R-Smads（Smad1/2/3/5/8/9）、共調節型Co-Smad（Smad4）和抑制型I-Smads（Smad6/7）三大類，其中，Smad1/5/8/9 調節BMPs 信號轉導[14]。Tsukamoto 等[15]研究表明，雖 然Smad9 與Smad1 和Smad5 具有高度相似的結構，但Smad9 降低BMP 活性，抑制了Smads 的轉錄活性。Katakawa 等[16]研究也表明，Smad8/9在mRNA 水平上通過BMP 途徑調控，是一個獨特的R-Smad；Xu 等[17]研究發現，Smad9 蛋白參與鵝卵泡發育的啟動，并通過外顯子1 和內含子2 的同義突變改變鵝的產卵量；Yu 等[18]通過體內和體外試驗表明，Smad9 參與鵝卵泡的發育。因此，Smad9 在BMP/Smad 信號通路的調節中起至關重要的作用。張小輝[19]通過生物信息學分析表明，牛Smad9基因在不同的組織中廣泛表達，但尚未在牛卵巢卵泡中具體研究其表達和定位。本研究通過免疫組化對Smad9 進行免疫定位，并檢測Smad9基因和Smad9 蛋白在牛小、中、大卵泡顆粒細胞中的表達，為Smad9基因和Smad9 蛋白在牛卵巢卵泡中的功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 從山西省呂梁市文水縣屠宰場采集健康且發情周期處于第II、IV 階段的成年母牛卵巢[20]。

1.2 實驗試劑 RNAiso Plus、反轉錄試劑盒、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（日本，TaKaRa）；增強型RIPA 裂解液、蛋白酶抑制劑（PMSF）、封閉蛋白干粉、4%多聚甲醛、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒、硝酸纖維素薄膜（NC 膜）、蘇木素（武漢，博士德生物工程有限公司）；SP Rabbit HRP Kit（DAB）、蛋白上樣緩沖液（5X）（北京，康為世紀生物科技有限公司）；M5 Prestained Protein Ladder with 45 ku（10～180 ku）（北京，聚合美生物科技有限公司）；Rabbit Anti-SMAD9 antibody (bs-4253R)（北京，博奧森生物技術有限公司）；β-actin polyclonal antibody（美國，BioWorld）、IRDye800CW Goat anti-Rabbit（美國，LI-COR）；無水乙醇、二甲苯、異丙醇、氯仿等分析純試劑為國產試劑；引物均來自上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分離牛小、中、大卵泡并收集顆粒細胞 成年母牛屠殺后，用滅菌4℃杜氏磷酸緩沖液（DPBS）清洗卵巢2 次，去除血液，分離卵泡，并按照相關文獻[21-24]將收集到的卵泡分為小（2 mm ≤直徑≤4 mm）、中（4 mm<直徑<8 mm）、大（直徑≥8 mm）3 類，再次用DPBS沖洗卵泡，去除卵泡表面的組織塊，分別放入裝有PBS的3 個表面皿中，用注射器扎破卵泡，將卵泡剪開，用刮刀刮取卵泡內壁顆粒細胞，收集含有顆粒細胞的PBS于15 mL 管內，800×g 離心5 min，留沉淀，保存于-80℃備用。

1.3.2 牛卵巢卵泡免疫組織化學 將分離得到的不同直徑的卵泡浸于盛有4%多聚甲醛的50 mL 離心管中，4℃過夜。脫水包埋于石蠟中，制成6 μm 的石蠟切片，在3% H2O2中浸泡10 min，再使用檸檬酸鈉緩沖溶液進行抗原熱修復。Smad9 抗體以1:100 的比例進行稀釋，一抗孵育過夜，在37℃溫箱中復溫30 min，PBS 洗滌2 次，3 min/次，二抗孵育10 min，PBS 洗滌2 次，3 min/次，配置DAB 顯色液，進行DAB 染色，達到最佳染色效果后，自來水沖洗，終止顯色。用蘇木精對切片復染后，將切片脫水，中性樹脂封片，用生物顯微鏡觀察并進行拍照。

1.3.3 RT-qPCR 按照RNAiso Plus 說明書要求，向樣品中添加RNAiso Plus，依據Trizol 法獲得每組顆粒細胞的RNA。用核酸測定儀測定每組RNA 濃度，將RNA反轉錄成cDNA。引物序列見表1，根據GenBank 中收錄的牛（Bos taurus）Smad9基因（NM_001076928.1）mRNA 序列設計引物，選用RPLP0作為qPCR 試驗的內參基因。按照熒光定量試劑盒說明，反應體系10 μL：Sense Primer 0.4 μL（0.4 μmol/L），Anti-sense Primer 0.4 μL（0.4 μmol/L），TB Green Premix Ex Taq II（2X）5 μL，去RNA 酶H2O 3.2 μL，cDNA 模 板1 μL（100 ng）。反應條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，循環45 次；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 5 s。每個樣做3 個檢測重復。

1.3.4 Western Blotting 將增強型RIPA 裂解液（含1%PMSF）向收集小、中、大卵泡顆粒細胞的1.5 mL離心管中各加200 μL，30 min 后4℃離心，通過BCA法測定蛋白濃度。以4:1 的比例將蛋白與蛋白上樣緩沖液（5'）混勻，100℃變性10 min。通過非還原的10%SDS/PAGE 凝膠分離蛋白，并將蛋白轉移到NC 膜上，其中，電泳條件：80 V 30 min；120 V 80 min；轉膜條件：100 V 90 min。然后將NC 膜用5% 脫脂奶粉溶液孵育1 h。之后用TBST 洗3 次，5 min/次，然后將Rabbit Anti-SMAD9 antibody 與TBST 以1:500 稀釋，4℃孵育過夜（12～16 h），用TBST 洗3 次，8 min/次，避光孵育二抗（1:18 000）1 h。用TBST 洗3 次，8 min/次，再將NC 膜浸于TBS 中5 min。將NC 膜置于Odyssey CLx 中依次曝光。

1.4 統計分析 qPCR 數據運用2-ΔΔCT法進行分析，內參基因為RPLP0基因。Western blotting 數據用Image J和Image Studio Ver 進行分析，內參蛋白為β-actin。數據重復3 次，且均經SPSS 22.0（IBM SPSS Statistics 22.0）進行單因素方差分析，數據用平均值±標準差表示，P<0.05 為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著。

2 結果

2.1 Smad9 在牛小、中、大卵泡中的定位分析 使用Smad9 抗體對牛卵巢切片進行免疫染色（400'），結果如圖1 所示，對照組無特異性免疫染色，實驗組Smad9在顆粒細胞層和膜細胞層中有免疫反應。實驗組Smad9在小卵泡和中卵泡顆粒細胞層中有明顯的免疫反應，呈顏色較深的棕褐色，而在大卵泡顆粒細胞層中免疫反應弱，呈顏色較淺的棕黃色；與顆粒細胞層相比，Smad9在小卵泡和大卵泡膜細胞層中免疫反應較弱，呈顏色較淺的棕黃色，而中卵泡與小卵泡、大卵泡相比免疫反應較強，呈棕褐色。

圖1 牛卵泡Smad9 的表達（400×）

2.2Smad9在牛小、中、大卵泡顆粒細胞中的mRNA表達 如圖2 所示，小卵泡和中卵泡GC 中Smad9mRNA 轉錄本相對豐度低于大卵泡GC（P<0.01），而中卵泡的GC 內Smad9mRNA 轉錄本相對豐度低于小卵泡（P<0.05）。

2.3 Smad9 在牛小、中、大卵泡顆粒細胞中的蛋白表達如圖3 所示，以β-actin 為內參，小、中、大卵泡的顆粒細胞中Smad9 蛋白表達量有差異。大卵泡顆粒細胞中Smad9 蛋白含量約為小卵泡的1.4 倍（P<0.01），約為中卵泡的1.5 倍（P<0.01），而中卵泡GC 中Smad9蛋白含量是小卵泡的0.9 倍（P<0.05）。

圖2 小、中、大卵泡中Smad9mRNA 相對豐度（n=3）

圖3 小、中、大卵泡中Smad9 蛋白相對表達量（n=3）

3 討 論

牛屬于單胎哺乳動物，卵泡發育過程包括卵泡的募集、選擇、優勢化以及閉鎖和成熟卵泡的排卵過程[25]。卵泡募集過程中，每個卵泡發育波有4～10 個直徑約為4 mm 的卵泡進行募集[26]。募集完成后，只有1～2 個卵泡被選擇變為優勢卵泡，其他卵泡變為從屬卵泡[27]，此時優勢卵泡約為8 mm，其他卵泡受激素影響將閉鎖退化。牛卵泡在進行募集過程中卵泡的大小為2～4 mm，卵泡選擇過程中卵泡的大小為4～8 mm，卵泡的優勢化后卵泡的直徑大于8 mm，即小卵泡（2 mm ≤直徑≤4 mm）、中卵泡（4 mm<直徑<8 mm）、大卵泡（直徑≥8 mm）[24]，牛卵泡的發育過程受多種內源性因素調控，其中BMP/Smad 信號通路起關鍵作用。

在BMP/Smad 信號通路中，Smad9 是重要的轉錄調節因子，在不同組織中廣泛分布，同時調節多種類型細胞的生長發育[16,19]，Tsukamoto 等[15]研究表明Smad9 是一種新型轉錄調節因子，Smad8/9 在BMP/Smad 信號通路中有顯性負調節作用。Yu 等[18]通過分離鵝的不同大小卵泡進行免疫組化試驗，首次揭示了Smad9 在不同發育階段卵泡的顆粒細胞層中特異性表達。同時，余道倫[28]研究表明，Smad9 僅在小鼠卵泡的顆粒細胞層中表達。本研究通過免疫組化試驗顯示，Smad9 在牛小、中、大卵泡的顆粒細胞和膜細胞層中有表達。Smad9 在不同物種的定位不同表明其具有物種特異性。Yu 等[18]研究表明，在鵝不同大小的卵泡中Smad9 的蛋白質和mRNA 表達有差異，揭示了Smad9蛋白和mRNA 表達的時空模式。本研究結果顯示，在基因和蛋白水平上Smad9 表達存在差異，大卵泡的顆粒細胞中Smad9 的相對表達量與小卵泡、中卵泡差異極顯著，而小卵泡的顆粒細胞中Smad9 的相對表達量與中卵泡存在顯著差異，提示Smad9 可能調節卵泡的募集、選擇與優勢化過程。Xu 等[17]研究發現，Smad9具有高度保守的結構域，Smad9與鵝卵泡的生長發育密切相關，并且Smad9mRNA 和Smad9 蛋白質的表達影響雌二醇的分泌、LHR的表達以及顆粒細胞的增殖。余道倫等[28]在使用RNA 干擾技術干擾Smad8 后，發現小鼠卵泡的顆粒細胞分泌雌二醇的能力減弱，并且LHRmRNA 表達水平下降，顆粒細胞的增殖明顯減弱。王和建等[29]通過小鼠腹腔注射BMP4，誘導Smad9 的表達增加，促進有腔卵泡的數目增多。Zhang 等[30]研究表明，Smad9 與雌二醇的分泌和LHR 的轉錄呈正相關，并影響顆粒細胞增殖。由此得出，Smad9 影響顆粒細胞的增殖和類固醇激素的分泌，從而影響卵泡的發育。本研究中Smad9 在牛小、中、大卵泡的顆粒細胞中表達存在差異，推測Smad9 可能調節牛卵泡的募集、選擇和優勢化過程。因此，下一步將進行Smad9 的功能研究，為改善母牛繁殖能力提供新思路。

4 結論

本實驗結果顯示，牛卵泡的顆粒細胞層中有Smad9表達，不同直徑卵泡的顆粒細胞中Smad9 的表達量不同，Smad9 大卵泡中的表達量極顯著高于小卵泡和中卵泡。因此，Smad9 可能參與有腔卵泡的發育過程。