甘氨酰tRNA 合成酶在小鼠圍著床期子宮及蛻膜化過程的時空特異性表達

姜 南，王一妹，馬興紅

（東北農業大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150030）

小鼠早期妊娠包括受精、著床前胚胎在輸卵管中的發育、胚胎著床和基質細胞蛻膜化等幾個重要過程。子宮由子宮腔上皮細胞、基質細胞及腺體組成。在卵巢雌激素和孕酮的協同影響下，著床期間的子宮發生顯著的形態和分子上的變化。小鼠胚胎在妊娠第5 天進行著床，胚胎著床后，著床胚胎周圍的基質細胞分化為特殊的蛻膜細胞，這個過程被稱為蛻膜化[1]。蛻膜是妊娠期間的臨時組織，通常是雙核或多倍體[2]。蛻膜具有多種功能，如提供支持胚胎發育的生長因子和細胞因子的來源，在妊娠期間發揮免疫調節作用，以及調節滋養層的侵襲 。

氨基酰tRNA 合成酶（Aminoacyl-tRNA Synthetase，AARS）參與催化所有生物體蛋白質合成過程，將特定的氨基酸連接到它們的同源tRNA 上形成氨基酰tRNA[3]。除了這種典型的功能外，最近的幾項研究表明，一些AARS 家族成員可能在多種生理條件下具有額外的細胞因子樣活性，如葡萄糖穩態[4]、炎癥[5]、血管生成[6]、細胞增殖[7]和凋亡[8]。近年來，AARS 家族成員甘氨酰tRNA 合成酶（Glycyl-tRNAsynthetase，GlyRS）在腓骨肌領域研究較多[9]。也有研究表明GlyRS與抗腫瘤應答以及奶牛乳腺上皮細胞泌乳和細胞增殖分化有關[10]。本研究通過構建小鼠早期妊娠和人工誘導蛻膜化模型，從體內體外2 個方面研究GlyRS的表達規律，探究GlyRS 在妊娠建立過程中的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 性成熟ICR 品系小鼠購買自哈爾濱醫科大學第二附屬醫院。人工控制飼養環境為室溫23℃，光照周期為12 h 光照、12 h 黑暗，自由進食及飲水。

1.1.2 實驗動物模型 ①早期妊娠：將性成熟的雌性小鼠與雄性小鼠按3:1 的比例于16:00 合籠交配，次日08:00 檢查發現陰道栓記為妊娠第1 天，分別于每天09:00 前收集小鼠妊娠第1～8 天子宮。收集小鼠妊娠第2～4 天子宮時，以從輸卵管或子宮中沖出胚胎為依據。收集小鼠妊娠第5 天子宮時，尾靜脈注射1%的芝加哥藍以確定著床位點。收集小鼠妊娠第6～8 天子宮時，能明顯觀察出著床位點，可直接取材。將子宮切成適當大小，一部分經液氮速凍后放入-70℃冰箱凍存，另一部分用固定液固定進行石蠟包埋。②人工誘導蛻膜化：將性成熟且結扎后的健康雄性小鼠與性成熟的雌性小鼠按1:1 的比例合籠交配，次日08:00 檢查發現陰道栓記為假孕第1 天。在其假孕第4 天時，對其右側子宮的子宮角進行芝麻油注射，另一側不注射，作為對照。在其假孕第8 天09:00 取材，取材方法同早期妊娠模型中的方法。

1.2 實時定量PCR

1.2.1 引物設計合成 根據熒光定量設計要求，于NCBI中獲取人GlyRS基因、GAPDH基因和PRL基因的mRNA 序列并用Primer 5 進行引物設計。選取引物（表1）送擎科生物（哈爾濱）公司進行合成。

1.2.2 總RNA 提取和cDNA 合成 按照RNA 提取試劑盒（TRIzol?Reagent kit，Invitrogen 公司）說明進行人子宮內膜基質細胞總RNA 提取實驗。Nano Drop 2000（Thermo 公司）測定RNA 純度及濃度；使用反轉錄試劑盒（GoScript Reverse Transcription Mix，Promega公司），反轉錄合成cDNA，保存于-20℃冰箱。

1.2.3 實時熒光定量PCR 使用TransStart?TopTaq 試劑盒（TransGen Biotech 公司），反應體系為20 μL：Anchored Oligo (dT)18 Primer 1 μL，2×TS Reaction Μix 10 μL，TransSceipt?RT/RI Enzyme Μix 1 μL，gDNA Remover 1 μL，RNA template 1 μL，RNase-Free Water 6 μL，反應條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 個循環后收集熒光信號。在ABI Prism7500 機器中進行，導出CT 值后采用2-ΔΔCT進行數據分析。

1.3 原位雜交

1.3.1 小鼠GlyRS基因片段克隆及探針的制備 根據GenBank 相關序列設計小鼠GlyRS基因的上、下游引物（上游引物：5'-CCACTGAGCCAGAACCAAGA-3'；下游引物：5'-GGAGTAAAACCAAGCAGCCA-3'），以小鼠子宮cDNA 為模板進行PCR 擴增，使用AxyGen膠回收試劑盒純化產物。將產物與pGEM-T 載體連接，連接產物轉化至DH5α感受態細胞中，挑取單一菌落進行搖菌，將菌液送至哈爾濱擎科生物公司進行測序，將測序正確的GlyRS基因片段利用Roche 公司的地高辛標記試劑盒進行探針標記。

1.3.2 原位雜交 將凍存的小鼠子宮組織7 μm 冰凍切片、10%中性福爾馬林溶液中固定1 h。使用地高辛標記的GlyRSRNA 探針于雜交液中，55℃雜交過夜。洗滌，1% 封閉液室溫封閉1 h 。堿性磷酸酶標記的抗地高辛抗體4℃避光孵育過夜。滴加NBT/BCIP（1:50）與2 mmol/L 左旋咪唑室溫顯色8 h，甲基綠染液對染，封片拍照。

1.4 免疫組織化學 將石蠟包埋的小鼠子宮組織7 μm石蠟切片、烘片1 h。二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水；98℃抗原修復10 min；3%雙氧水處理10 min；10%馬血清室溫避光封閉1 h；兔抗小鼠GlyRS 多克隆抗體（1:500，absin 公司）4℃避光孵育過夜；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（ProteinTech 公司）室溫避光孵育1 h；DAB 顯色；蘇木精對染；稀釋后的鹽酸氨水反藍、梯度乙醇脫水、透明、封片拍照。

表1 引物序列

1.5 蛋白質印跡分析 提取小鼠子宮組織蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒（Biosharp 公司）測定蛋白樣品濃度。將相同質量的蛋白樣品煮沸并變性，制作蛋白質凝膠，80 V 恒壓條件下進行SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h。恒流200 mA 條件下濕法轉膜90 min，37℃封閉1 h，兔源GlyRS一抗（1：600，absin 公司）和GAPDH 一抗（1:500，ProteinTech 公司）4℃孵育過夜。PBST 洗滌3 次，山羊抗兔IgG（ProteinTech 公司）37℃孵育1 h，PBST 洗滌3 次，ECL 超靈敏發光溶液（南京諾唯贊公司）顯影，曝光。

1.6 體外誘導人子宮內膜基質細胞蛻膜化 配制不含有酚紅的DMEM/F-12（1:1）培養基，傳代培養人子宮基質細胞，隔天換液；細胞密度達到80%時，去除培養液，HBSS 緩沖液清洗3 次；胰酶消化后吹打混勻轉移至離心管中離心，除去上清加入新鮮培養液；重懸細胞接種到6 孔板中并隔夜換液，在細胞密度達到80%時誘導細胞。誘導組培養液配方：10 nmol/L 雌二醇、1 μmol/L 醋酸甲羥孕酮（雌二醇和醋酸甲羥孕酮的溶劑均為無水乙醇），并加入終濃度為0.5 μmol/L 的二丁酰環腺苷酸（Sigma 公司）；對照組則加入相同體積的無水乙醇；在37℃ 5% CO2條件的培養箱中培養，隔天換液。依次收集第1、2、4、6 天誘導組和對照組的細胞，提取RNA 進行后續的檢測。

1.7 統計分析 利用GraphPad Prism 5.0 軟件分析數據。結果用平均值±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析或Student'st檢驗，α為0.05。利用ImageJ 軟件對灰度進行相對定量分析，以GAPDH作內參。

2 結果

2.1GlyRS在小鼠早期妊娠子宮中的表達情況 原位雜交、免疫組織化學和蛋白質印跡結果表明，GlyRSmRNA 和蛋白在小鼠早期妊娠第1～4 天子宮腔上皮和腺上皮表達較弱。隨著妊娠的進行，胚胎在第5 天成功植入，并且胚胎周圍的基質細胞增殖形成初級蛻膜區，隨后幾天初級蛻膜區的基質細胞增殖并分化成次級蛻膜區。GlyRSmRNA 和蛋白在第5、6 天的初級蛻膜區以及第7、8 天的次級蛻膜區表達并逐漸增強（圖1）。

圖1 GlyRS 在小鼠早期妊娠子宮中的表達情況

2.2GlyRS在小鼠人工蛻膜化模型子宮中的表達情況由圖2 可知，GlyRSmRNA 和蛋白在小鼠人工蛻膜區子宮中的表達高于非蛻膜區。

2.3GlyRSmRNA 在體外誘導蛻膜化人子宮內膜基質細胞中的表達 人子宮內膜基質細胞的蛻膜化標志物PRLmRNA 的表達隨誘導天數的增加而增加，證明了成功的誘導作用和高效率（圖3-A）。GlyRSmRNA 在體外誘導蛻膜化人子宮內膜基質細胞中的表達量高于對照組，并且隨誘導天數的增加而增強（圖3-B）。

3 討 論

圖2 GlyRS 在小鼠人工蛻膜化子宮中的表達情況

圖3 GlyRS mRNA 在體外誘導蛻膜化人子宮內膜基質細胞中的表達

成功妊娠是物種延續與進化的先決條件，早期妊娠的質量對于后期的胚胎發育具有很大的影響，因而是妊娠成功的關鍵[11]。在哺乳動物早期妊娠過程中，胚胎植入到子宮中，與母體建立物理和生理聯系的過程稱為胚胎著床，是建立妊娠的關鍵步驟[12]。絕大多數的妊娠失敗均發生在圍著床期。在卵巢來源的雌激素和孕酮的協調作用下，著床胚胎周圍的基質細胞發生形態和分子方面的顯著的分化，稱為蛻膜化[13]。本研究發現，GlyRS主要定位于小鼠胚胎和蛻膜組織，而且GlyRS的表達隨著蛻膜化的進行而增強，這表明GlyRS基因參與了子宮基質蛻膜化的過程。此外，在體外培養人子宮基質細胞并誘導蛻膜化模型中，隨著蛻膜化誘導的逐漸增強，GlyRS的表達也隨之增強，表明GlyRS可能在哺乳動物的蛻膜化過程中發揮比較保守的作用。

近年來，人們發現氨基酰tRNA 合成酶的功能與細胞增殖相關。抑制細胞周期蛋白依賴性激酶5（Cdk5）可以抑制磷酸化的谷氨酰脯氨酰tRNA 合成酶的磷酸化，阻止磷酸化的谷氨酰脯氨酰tRNA 合成酶從tRNA多合成酶復合物中釋放，并阻止mRNAs 的翻譯抑制，導致炎癥蛋白表達增加，促進細胞增殖[14]。如果在低色氨酸微環境下，色氨酰tRNA 合成酶會對小鼠腫瘤細胞的增殖起到促進作用[15]。同樣，甘氨酰tRNA 合成酶能夠正向調節奶牛乳腺上皮細胞中Cyclin D1 的表達量，最終促進奶牛乳腺上皮細胞增殖[16]。也有研究表明，GlyRS作為一種損傷信號，參與激活間充質干細胞的增殖、分化和遷移過程[17]。在哺乳動物胚胎著床和蛻膜化過程中，子宮細胞發生廣泛的增殖和分化，GlyRS在早期妊娠過程中如何發揮作用值得進一步研究。

雷帕霉素復合物的哺乳動物靶標（Mammalian Target Of Rapamycin，mTOR）是蛻膜營養傳感器的組成部分，mTOR 信號在細胞生長、代謝、細胞存活和遷移的調控中起著重要作用，是細胞新陳代謝、生長和存活的中樞調節因子[18]。妊娠小鼠的mTOR mRNA 水平從妊娠第3 天開始逐漸升高，在妊娠第5 天達到最大值，然后下降。mTOR的mRNA 和蛋白主要位于基質細胞中；妊娠第4 天清晨通過宮內注射雷帕霉素可大大減少著床位點的數量[19]。在子宮特異性缺失p53 的小鼠中，mTORC1 信號增強，蛻膜早衰，誘發妊娠小鼠早產，低劑量的mTORC1 抑制劑雷帕霉素可降低早產的發生率[20-21]。用抗糖尿病藥物二甲雙胍或抗氧化劑白藜蘆醇處理懷孕的p53 敲除小鼠可激活蛻膜細胞中的AMPK 信號傳導并抑制mTORC1 信號，二甲雙胍和白藜蘆醇均可預防p53 缺失引起的自發性和炎癥性早產[22]。有研究發現人的蛻膜化與mTOR 信號通路亦相關[23-24]。此外，還有研究證明甘氨酰tRNA 合成酶介導氨基酸誘導的mTOR 途徑的激活，從而調節牛奶蛋白和脂肪的合成[25]。本研究發現，在小鼠蛻膜組織和人子宮基質細胞體外蛻膜化過程中高表達GlyRS，GlyRS與mTOR 通路的激活是否有關值得進一步研究。

4 結 論

綜上所述，GlyRSmRNA 和蛋白表達情況類似，都是在小鼠早期妊娠第1～4 天的腔上皮和腺上皮表達，在第5～8 天的蛻膜區表達，并且隨著天數的增加而增強，在人工蛻膜化模型中蛻膜區表達。并且在體外誘導蛻膜化人子宮內膜基質細胞中，隨著誘導蛻膜化天數的增加GlyRSmRNA 也呈上升趨勢且高于對照組，表明GlyRS參與了小鼠胚胎著床和蛻膜化的過程。本研究揭示了GlyRS在小鼠圍著床期子宮中的表達規律，為進一步深入研究其在哺乳動物妊娠中的功能提供了基礎。