熱應激下泌乳母豬乳腺組織中circRNA 的識別與鑒定

倪一凡，蔡劍鋒，陳強強，胡金平，沈家聰，張金枝*

（1.浙江大學動物科學學院，浙江杭州 310058；2.杭州大觀山種豬育種有限公司，浙江余杭 311100）

母豬熱應激（Heat Stress,HS）是母豬對高溫環境產生的非特異性反應的總和[1]。高溫環境嚴重影響母豬的攝食、繁殖、泌乳和新陳代謝[2-3]。其中，泌乳是一個動態的、多因素調節的復雜過程。高熱條件下，母豬皮膚毛細血管血流量增大、散熱增加從而影響母豬泌乳效率[4]。此外，HS 會導致母豬繁殖力下降、發病率增加，嚴重情況下會直接導致母豬死亡。我國南方夏季高溫時間長，嚴重影響母豬生產性能的發揮，研究HS 下母豬的泌乳機理具有重要意義。

環狀RNA（circRNA）作為一種非編碼RNA，廣泛存在于動物、植物、真菌的真核生物中，具有調節真核生物基因表達的作用[5]。circRNA 不具有5' 和3'末端，首尾共價鍵相連形成閉合環狀RNA 分子，不能被核糖核酸酶降解[6-7]，因此它比線性RNA 更穩定。近年來，豬相關的circRNA 研究越來越多。有研究發現circRNA 能夠調節豬的成脂分化和脂質代謝[7]，另外，豬肝臟中的circRNA 在肝臟代謝調控中起重要作用[8]。Zhang 等[9]研究發現一些circRNA 可以作為miRNA 的“分子海綿”來調節垂體特異性基因和熱休克蛋白家族成員的表達，說明母豬垂體中的circRNA 在HS 情況下發揮作用。然而，目前關于泌乳母豬乳腺的circRNA 研究還很少。本團隊前期研究發現HS 顯著降低母豬的泌乳量，并損傷泌乳母豬的生理功能[10]。此次研究通過轉錄組測序技術對HS 下泌乳母豬乳腺中的circRNA 進行識別和鑒定、功能分析、構建circRNA與miRNA 互作網絡，旨在篩選與泌乳性能相關的候選circRNA。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本實驗選取長白泌乳母豬作為研究對象，檢測在不同環境溫度下泌乳母豬的泌乳指標，取HS 和正常環境溫度下泌乳母豬的乳腺組織，通過轉錄組測序以探討HS 情況下母豬乳腺組織中circRNA 的表達情況。實驗在浙江省杭州市大觀山種豬育種有限公司進行。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品收集和RNA 分離 本實驗分2 個階段，首先在8 月1 日—9 月3 日進行HS 養殖實驗，在11 月22 日—12 月24 日進行正常養殖實驗（實驗組和對照組實驗時長由實驗母豬分娩日期決定）。2 個階段各選取20 頭胎次體重和分娩日期相近的妊娠長白母豬進行實驗，2組實驗中的每頭妊娠母豬都在產前7 d 提前進入產房進行預實驗，以仔豬出生到28 日齡斷奶作為一個正試期，測定2 種狀態下泌乳母豬的日均泌乳量、血液生化及免疫指標[10]。除了環境溫度不同外，HS 組與正常（TC）組中其他飼養管理條件完全一致。在哺乳的第28 天（仔豬斷奶日）從2 組中均隨機挑選3 頭泌乳母豬，收集乳腺組織（HS：H-RX1，H-RX2 和H-RX3；TC：L-RX1，L-RX2 和L-RX3），并保存在-80℃直至提取RNA。然后按照說明使用TRIzol 試劑從乳腺組織中分離出總RNA。使用Thermo Scientific Nanodrop NC2000（Thermo Scientific，NY，USA）檢測樣品RNA 的濃度和純度，使用Agilent 2100 生物分析儀（美國加利福尼亞州安捷倫科技公司）的RNA 6000 Nano Kit 5067-1511 來確定RNA 的完整性。

1.2.2 RNA 文庫的構建和測序 首先，使用美國Illumina公司Ribo-Zero rRNA Removal Kit 去除乳腺組織總RNA樣品中的rRNA、線性RNA，并將RNA 片段化為200～300 bp。然后，以circRNA 片段為模板，使用隨機的六核苷酸引物合成cDNA 第1 鏈；再以第1 鏈cDNA 為模板，合成cDNA 第2 鏈。當合成第2 鏈cDNA 時，使用dUTP 代替dTTP，并且將不同的銜接子連接到第2 條鏈的5' 末端和3' 末端。隨后，在DNA 片段的3' 末端進行腺苷酸化后，將進一步的雜交與Sequencing Adapter 連接。最后，進行PCR 擴增以富集cDNA 文庫，在Illumina Hiseq 2500 平臺上運行Pair End 標準測序程序。

1.2.3 circRNA 的鑒定和差異表達分析 使用Cutadapt（v1.15）從原始數據中過濾包含少量帶有測序接頭、ploy-N 或測序質量較低的reads，最終可以獲得clean reads。使用Tophat 2.0.14 將過濾后的測序序列與豬的參考基因組（asia.ensembl.org/index.html）進行比對；使用Bowtie2 將未映射讀段的20 bp 末端進行融合基因比對，使用find_circ 軟件驗證circRNA。統計分析鑒定的circRNA 的染色體分布和類型。DE Seq（1.30.0）軟件用于分析差異表達的circRNA，比較TC 組和HS 組，以|log2(ford change)| ≥1 為閾值，P<0.05 的circRNA被認為顯著差異；并使用R 語言P heatmap（1.0.8）軟件包對circRNA 進行雙向聚類分析（http://CRAN.R-project.org/package=pheatmap）。

1.2.4 功能富集分析和靶向預測 使用DAVID（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）和KEGG 數據庫（http://www.genome.jp）對差異表達的circRNA 的親本基因進行GO 富集分析和KEGG 通路分析，P<0.05 被認為顯著富集。由于circRNA 可以充當miRNA 的“分子海綿”來調節基因表達[11]，使用miRanda 軟件（http://www.mirbase.org/index.shtml）進行miRNA 預測，以進一步研究circRNA 的功能，并使用Cytoscape v3.4 軟件繪制circRNA-miRNA 互作網絡圖[12]。

1.2.5 實時定量PCR（qRT-PCR）驗證 從測序所得的差異表達的circRNA 中，隨機選取5 個進行驗證，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉錄試劑盒（TaKaRa,China）來合成cDNA。然后以cDNA為模板，用SYBR Premix Ex TaqTM（Takara，Hangzhou，China）的熒光定 量PCR 試劑在Thermo Scientific StepOnePlus 進行qRT-PCR 反應。反應中以甘油醛 3 磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參，引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結果

2.1 circRNA 的鑒定 使用RNA-seq 對乳腺組織進行轉錄組分析以鑒定在HS 中對母豬泌乳相關的circRNA，測序結果列于表2。除去接頭序列、ploy-N、低質量的reads 后，獲得了80 407 848 至85 984 968 的clean reads。使用TopHat 2.0.14 將這些reads 的83.78%定位到參考豬基因組的未融合基因，并且將83.33%以上的位點獨特定位。從6 個樣品中共鑒定出20 311 個候選circRNA，其中大多數分布在1 號染色體上，其次是13號和6 號染色體（圖1-A）。此外，根據circRNA 結果和find_circ 識別出的基因組注釋信息，這些circRNA 被分為6 種類型，其中annot_exons 類型最多（圖1-B）。

2.2 circRNA 的差異表達分析 根據|log2(ford change)|>1和P<0.05，計 算HS 組 和TC 組之間差 異表達的circRNA，以更好地研究HS 環境中母豬泌乳的調控機制。與TC 組相比，HS 組共獲得了187 個差異表達的circRNA，其中106 個上調，而81 個下調（圖2-A）。如圖2-B 所示，H-RX 和L-RX 在基因表達水平上的模式明顯不同，這表明RNA 序列的結果是有效的并且可以進一步分析。

2.3 宿主基因的功能富集分析 GO 富集分析表明，差異表達的circRNA 的大多數親本基因在Rab GTPase 結合、生物學負調控的過程和Ras GTPase 結合方面均顯著富集（圖3-A）。此外，KEGG 途徑分析表明，差異表達的circRNA 的大多數親本基因均與cAMP 信號傳導通路、HIF-1 信號傳導通路、FoxO 信號傳導通路和Ras 信號傳導通路顯著相關（圖3-B）。

2.4 circRNA-miRNA 互作網絡預測 circRNA 被證實可以作為miRNA 的“分子海綿”，與miRNA 競爭結合調節基因的表達。circRNA-miRNA 預測結果顯示，同一個circRNA 可以靶向多個miRNA，同一個miRNA可以被多個circRNAs 靶向。在這里，187 個差異表達的circRNAs 可以跟466 個miRNA 互作。為了更直觀地展現兩者之間的相互關系，選取6 個circRNAs（ssccirc_134615、ssccirc_096340、ssccirc_104399、ssccirc_098353、ssccirc_078984 和ssccirc_135768），利用Cytoscape v3.4 制作了circRNA-miRNA 相互作用網絡圖（max-energy<-25）（圖4）。

2.5 熒光定量PCR驗證 隨機選取5個circRNAs（ssccirc_092780、ssccirc_002690、ssccirc_095321、ssccirc_051419、ssccirc_078984）進行qRT-PCR 以驗證RNA 測序結果的可靠性，結果如圖5 所示，qRT-PCR 結果與測序結果一致，說明測序結果可靠。

3 討 論

泌乳是哺乳動物普遍存在的特征，也是哺乳動物繁殖過程中重要的環節[13]。在實際生產過程中HS 嚴重影響了母畜的泌乳量和乳成分，給養殖業造成巨大損失[14]。有研究在產后第1 天（D1）和第7 天（D7）從泌乳的大鼠乳腺中分別鑒定到6 824 個和4 523 個circRNAs[15]；在產后第90 天和250 天的牛乳腺組織中分別鑒定出4 804 個和4 048 個circRNAs[16]。此外，在人類乳腺中共檢測到9 665 個circRNAs[17]。本次研究中，在母豬乳腺中共鑒定出20 311 個circRNAs，其中相比于常溫，HS 組有187 個circRNAs 差異表達，包括106個上調和81 個下調。上述不同結果可能是由于哺乳動物的乳腺組織發育與激素水平、品種、遺傳性能、營養狀況和飼養管理等有關。

表2 測序結果

圖1 染色體分布圖（A）和類型分布圖（B）

圖2 火山圖（A）和聚類分析圖（B）

圖3 親本基因的GO 富集分析圖（A）和KEGG 通路分析圖（B）

圖4 circRNA-miRNA 互作分析圖

圖5 熒光定量PCR 驗證測序結果

一些研究表明，circRNA 通過特定的RNA-RNA相互作用調節其親本基因在cis 中的聚合酶II 轉錄[18]。因此，本文通過探索與circRNA 相關的親本基因的潛在功能來研究circRNA 的功能。GO 功能富集分析表明，差異表達的circRNAs 的大多數親本基因與Rab GTPase結合、生物學過程的負調控、Ras GTPase 結合顯著相關。Rab 蛋白屬于小鳥苷三磷酸酶（GTPases）超家族，它作為分子開關在真核細胞轉運過程中發揮重要作用[19]。因此，本文推測高溫可能會影響細胞的正常功能。通過KEGG 信號通路分析，親本基因富集最多的通路為cAMP 信號通路、HIF-1 信號通路、FoxO 信號通路和Ras 信號通路。本研究中，差異表達的sscirc_044883和ssccirc_008385 的親本基因MAPK10 富集在cAMP信號通路。MAPK 是多種生物化學信號通路的整合點，參與細胞增殖、分化等多種過程[20]，而cAMP 信號通路的激活也可能與熱應激下母豬采食量減少有關[21]。此外，低氧誘導因子HIF 可以作為細胞對低氧應激反應的主要調節因子。據報道，HIF-1 信號通路在所有生物體中可以激活同源或相似的基因表達，導致類似的生物化學反應，其中包括氧傳感器動員、氧運輸和血管細胞的生成[22]。泌乳期間，乳腺中氧氣的供應對細胞存活和維持泌乳至關重要，然而在泌乳期乳腺通常會發生缺氧[23]。本研究中親本基因ENSSSCG00000005096（HIF1A）富集在HIF-1 信號通路，HIF1A（低氧誘導因子1α）是低氧反應的主要調節因子，在乳腺上皮細胞的分化和功能發揮中起關鍵作用，是維持正常泌乳和產奶所必需的[24-25]。HS 下的泌乳母豬會缺氧并減少采食量，進而導致產奶量減少，這可能會阻礙泌乳期間仔豬正常的生長發育。

豐富的內源性circRNA 可以作為有效的miRNA“分子海綿”，從而增加基因表達調控功能的生長庫[26]。目前已經報道了許多miRNA 參與HS 的反應，包括miR-34a[27-28]、miR-21-5p[29]和miR-181b[30]。其中，miR-34a 是p53 的效應子，與DNA 損傷和修復、細胞周期阻滯和細胞凋亡有關[27]。Yu 等[28]研究發現，熱處理后大鼠小腸中rno-miR-34a 明顯上調，推測miR-34 可能會參與HS 誘導的腸上皮細胞凋亡過程中。Li 等[29]研究鑒定出差異表達的bta-miR-21-5p 可能在HS 期間起主導作用，它們通過上調或下調差異表達的miRNA 減少HS 對荷斯坦奶牛的傷害。同時，有研究發現HS 下的荷斯坦牛中，miR-181b 與免疫反應有關[30]。因此，本研究中，為了進一步揭示circRNA 的重要功能，使用miRanda 軟件來預測潛在的miRNA 結合位點，根據所有極顯著（P<0.01）circRNA 的表達來篩選出候選的miRNA，共鑒定出307 個差異表達circRNA 可以作為457 個miRNA 的海綿，從中發現miR-34a、miR-21-5p 和miR-181b 與sscirc_078984、sscirc_098353和sscirc_135768 靶向結合。這些預測結合位點表明circRNA 在HS 下通過miRNA 相互作用調節泌乳過程。

4 結 論

本實驗通過RNA-seq 技術對HS 和常溫條件下泌乳母豬的乳腺進行高通量轉錄組測序和分析，發現共有187 個差異表達的circRNAs，包括106 個上調和81 個下調；對差異表達的circRNA 的親本基因進行功能分析和互作分析，初步發現，sscirc_078984、sscirc_098353和sscirc_135768 可能參與HS 下母豬泌乳的調控，為后續circRNAs 對母豬泌乳的研究提供了理論基礎。