小尾寒羊S100A1 基因編碼區外顯子克隆及表達分析

肖 成，薛佳佳,2，王 晶,3，柳儉強，于永生，張立春，馬惠海，金海國*，曹 陽*

（1.吉林省農業科學院，吉林公主嶺 136100；2.吉林農業大學動物科技學院，吉林長春 130000；3.延邊大學農學院，吉林延吉 133000）

小尾寒羊是我國地方品種，具有高繁殖力、耐寒、抗逆性強等特點，但其肉質不如國外其他肉羊品種[1]。隨著人們生活水平的提高，高品質羊肉越來越受消費者歡迎，因此提高小尾寒羊肉品質以及選育高品質肉羊品種是目前需要解決的一大難題。肌內脂肪含量與肉色、肉嫩度及品質密切相關，提高其肌內脂肪含量能夠顯著提升肉質。肌內脂肪含量增加是新的脂肪細胞產生以及已有脂肪細胞增殖肥大的過程。新脂肪細胞形成及成熟需要經歷細胞增殖和分化2 個階段，期間大量基因、激素、轉錄因子等參與調控[2]。因此，遺傳因素是影響肌內脂肪含量形成及脂肪細胞分化的關鍵因素，尋找參與小尾寒羊脂肪形成的新候選基因成為關鍵。本實驗室前期通過轉錄組測序發現，在小尾寒羊前體脂肪細胞發育為成熟脂肪細胞過程中，存在大量的差異表達基因，其中S100 鈣結合蛋白A1（S100 Calcium Binding Protein A1，S100A1）基因存在差異表達（未發表），但具體表達規律不清楚。S100A1 是一種鈣結合蛋白，參與心肌收縮、線粒體代謝，調節細胞內鈣離子平衡、血管功能。大量研究證明，S100A1基因主要與肌肉形成、心肌疾病、皮膚病及腫瘤癌癥有關[3-8]。也有研究發現，S100A1基因在小鼠脂肪細胞分化過程中差異表達[9]。但S100A1基因在其他物種與脂肪相關的研究仍不豐富。由于實驗室前期研究發現，S100A1基因可能與脂肪代謝有關（測序數據未發表），因此具有一定的研究價值。本文以小尾寒羊為動物樣本，首先檢測S100A1基因在不同日齡小尾寒羊脂肪組織中的表達差異，同時探索了S100A1基因在脂肪細胞分化過程中的表達規律，之后從分子層面研究其基因結構以及突變位點并與實際生產性狀做關聯分析。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本研究實驗動物為來自吉林省農業科學院動物生物技術研究所飼養的3 日齡和2 月齡小尾寒羊各1 只，6 月齡小尾寒羊63 只。3 日齡小尾寒羊用于提取脂肪組織RNA，6 月齡小尾寒羊3 只，用于提取各組織總RNA。60 只6 月齡小尾寒羊血液用于基因組提取。2 月齡小尾寒羊用來分離前體脂肪細胞。

1.2 主要試劑 血液基因組試劑盒來自AXYGEN 生物公司；細胞培養皿來自corning 公司；PBS 緩沖液、胰蛋白酶、膠原酶、胰島素、地塞米松等均來自Sigma 公司；TRIZOL 來自Invitrogen 公司；PCR 預混酶來自康為世紀生物公司；反轉錄試劑盒、DL2000 Maker 購自TaKaRa 生物有限公司；PCR 引物及測序服務由蘇州金唯智生物科技有限公司提供；LightCycler 480 SYBR Green I Master 由羅氏（中國）公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 分離小尾寒羊前體脂肪細胞并誘導 人道處死2 月齡小尾寒羊，無菌取腹股溝處白色脂肪組織，將組織剪成1 mm3方塊。膠原酶II 消化組織，經200 目及400 目濾網，過濾出未消化的組織及雜細胞。1 500 r/min 離心15 min，去除上清液，完全培養液重懸細胞并接種到35 mm 培養皿中，6 h 細胞貼壁，12 h 換液，除掉雜細胞及死細胞的影響。每48 h 換液，待細胞長滿培養皿，胰酶消化細胞，傳代培養。第4 代細胞進行體外誘導，胰島素、地塞米松以及IBMX 混合培養液作為誘導I 液誘導細胞，48 h 換誘導II 液（含胰島素的完全培養基），48 h 后換完全培養基。繼續培養直到顯微鏡下看到細胞出現脂滴，油紅O 染色驗證成熟的脂肪細胞。

1.3.2 提取小尾寒羊血液DNA 及各組織總RNA 取250μL 羊血進行基因組提取，操作按照AXYGEN 血液基因組提取試劑盒的說明書進行。人道處死6 月齡小尾寒羊3 只，無菌取下肌肉、脂肪、肺、脾、腸、心、肝組織。處死3 日齡小尾寒羊1 只，無菌取其腹部皮下脂肪組織，冷凍于液氮中。取黃豆粒大小組織進行液氮研磨，研磨后組織粉末用TRIZOL 處理，根據說明書，提取各組織總RNA。RNA 經瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測合格后，根據TaKaRa 反轉錄酶說明書體外合成cDNA，反轉錄體系為10 μL：5×PrimeScript RT Μaster Μix 2 μL、Total RNA 500 ng，RNase Free ddH2O 補充至10 μL。反應條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存。將cDNA 用雙蒸水稀釋10 倍，用于后續實驗。

1.3.3 引物設計、PCR 產物測序 根據Genbank 中預測的綿羊S100A1基因組及mRNA 序列（NC_040252.1；XM_00 4002529.3）、內參基因GAPDH序列（NM_001190390.1），利用Primer 5 軟件設計得到S100A1基因CDS 區引物以及各外顯子引物、實時熒光定量PCR 引物序列（表1）。

表1 S100A1 基因引物序列

1.3.4 引物特異性驗證 引物退火溫度與延伸時間見表1。擴增反應體系為20 μL：預混酶10 μL、上下游引物（10 pmol/μL）各0.5 μL、模 板1 μL、ddH2O 8 μL；擴增條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，退火溫度30 s，72℃延伸（延伸時間見表1），35 個循環；72℃延伸8 min，4℃保存。產物經瓊脂糖凝膠電泳實驗，條帶單一的PCR 引物可用于后續實驗。

1.3.5 連接載體及測序 將S100A1-CDS 以及基因的5個外顯子PCR 產物進行膠回收。回收產物與pMD18-T載體連接，連接體系為10 μL：T 載體1 μL、膠回收產物為0.1～0.3 pmol、補充到10 μL；4℃過夜。重組質粒轉化到感受態細胞中，冰浴30 min，42℃水浴90 s，冰浴5 min，37℃搖床搖1 h，以激活感受態細胞。取菌液100 μL 均勻涂到固體培養皿中，正面朝上放置在37℃培養箱30 min，然后將培養皿翻轉，正面朝下繼續培養16 h。挑克隆進行擴大培養，37℃搖床搖4 h 后進行菌液PCR 驗證，PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳實驗，條帶單一明亮的菌液進行測序。

1.3.6 生物信息學分析S100A1基因結構 小尾寒羊S100A1基因CDS 區及外顯子測序結果與網上預測序列進行比對。ExPASy 網站中ProParam 程序分析S100A1蛋白一級結構、理化特性；PROTEAN 軟件預測蛋白二級結構；Phyre 2 程序預測蛋白三級結構；Signal IP 預測信號肽；PSORT II 進行蛋白亞細胞定位。

1.3.7 實時熒光定量PCR 檢測小尾寒羊S100A1基因各組織表達譜，細胞各時期表達規律。qRT-PCR 體系為20 μL：Light Cycler 480 SYBR Green ⅠMaster（2×）10 μL、ddH2O 8 μL、cDNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL。反應程序：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃20 s共40 個循環，95℃ 5 s，65℃ 1 min，40℃ 10 s，每組實驗重復3 次。Roche Lightcycler 480 軟件進行數據分析。

1.4 統計分析 每組實驗重復3 次，數據以平均值±標準差表示，采用GraphPad Prism 軟件作圖，利用SPSS 17.0 軟件對數據進行t檢驗或單因素方差分析，顯著性水平定為P<0.05，極顯著水平定為P<0.01。

2 結果

2.1 小尾寒羊S100A1基因各組織RNA 表達譜 小尾寒羊各組織總RNA 經瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計測定，可以進行后續實驗。如圖1 所示，S100A1基因在心臟中表達量最高，其次是肺、腸、脾、腎、肝、肌肉、脂肪；6 月齡脂肪S100A1基因表達量顯著高于3 日齡。

2.2 小尾寒羊前體脂肪細胞培養與分化 小尾寒羊前體脂肪細胞貼壁之前為球狀，6 h 后細胞開始貼壁，呈不規則梭型。6 孔板培養細胞在第5 天細胞長滿，可以進行體外誘導分化，分化后細胞體積膨大，內部出現脂滴。油紅O 染色鑒定成熟脂肪細胞，脂滴能夠被染成紅色，如圖2 所示。

圖1 小尾寒羊各組織S100A1 基因及不同日齡相對表達量

圖2 小尾寒羊成熟脂肪細胞油紅O 染色圖

2.3 小尾寒羊S100A1基因在細胞分化期間的表達規律在小尾寒羊脂肪細胞分化過程中，分別于第0、2、4、6、8、10、12 天提取總RNA，進行實時熒光定量PCR 分析發現，S100A1基因在細胞長滿培養皿時表達量出現顯著升高，加入體外誘導劑，基因出現顯著降低，最后隨著細胞分化的開始，S100A1基因相對表達量顯著升高，并保持一定水平（圖3）。

圖3 小尾寒羊細胞分化過程S100A1 基因相對表達量

2.4 小尾寒羊S100A1基因編碼區及外顯子區克隆以及生物信息學分析 以小尾寒羊肝臟組織cDNA 為模板，克隆出S100A1基因的編碼區，測序結果見圖4。小尾寒羊S100A1基因與NCBI 網站上預測的結果一致，沒有出現突變。通過混池PCR 以及sanger 測序，成功克隆S100A1基因5 個外顯子，將測序序列與網站公布序列對比發現，5 個外顯子均不存在SNP 突變。編碼區序列經生物信息學分析后發現，S100A1基因CDS 區具有285 bp 的開放閱讀框，編碼94 個氨基酸。S100A1 蛋白分子量為10.52 ku；理論等電點4.39，為酸性蛋白；穩定系數8.96，為穩定蛋白；平均親水性-0.38，為親水蛋白；S100A1 蛋白氨基酸組成見表2。信號肽預測發現，蛋白為非分泌蛋白；S100A1 蛋白表達預測主要定位在細胞質52.2%、細胞核17.4%、線粒體13%、高爾基體4.3%、空泡4.3%；S100A1蛋白二級結構存在4 個α-螺旋、2 個β-折疊、6 個轉角、2 個卷曲（圖2）；蛋白質三級結構與二級結構預測一致，基本結構并不復雜，但會形成復雜的三維空間結構（圖6），其蛋白功能主要由二級結構及三級空間結構決定。

3 討 論

圖4 小尾寒羊S100A1 基因CDS 區序列比對圖

表2 小尾寒羊S100A1 蛋白氨基酸組成

圖5 小尾寒羊S100A1 蛋白二級結構

圖6 小尾寒羊S100A1 蛋白三級結構

S100 蛋白家族具有一定的保守性，家族成員結構類似、分子量為10～12 ku[10]。它具有細胞和組織的表達特異性，同時具有多種生理功能[11]。S100A1 是S100 蛋白家族成員之一，它能夠與鈣離子結合，參與機體多種生理功能。目前有關S100A1基因與脂肪相關的研究很少，所以本文探索了S100A1基因在羊脂肪代謝過程中的表達規律，并尋找基因突變位點。實驗表明，S100A1基因在小尾寒羊心臟組織的表達量最高。S100A1基因具有結合鈣離子、調節心肌收縮的功能，本實驗結果也說明了這一點，同時也間接增加了實驗數據的可信度。相比于其他組織，S100A1基因在脂肪組織的相對表達量較少，但S100A1基因的表達量隨著羊日齡的增加以及脂肪組織中新細胞增生肥大而出現顯著升高。這說明S100A1基因雖然不在脂肪組織中大量表達，但S100A1基因參與了動物脂肪發育過程。同時S100A1基因在綿羊脂肪細胞分化過程出現顯著變化，更加表明S100A1基因參與綿羊脂肪代謝過程。

為深入了解S100A1基因功能，研究探索了S100A1基因的結構。由于NCBI 網站公布的綿羊S100A1基因為預測序列，所以本實驗克隆了小尾寒羊S100A1基因的實際序列。結果發現實際序列與預測序列一致，不存在突變，這說明S100A1基因序列相對保守。S100A1蛋白分子式C464H722N116O154S4，為酸性蛋白，結構穩定，由于編碼序列少，所以蛋白的二級結構以及三級結構并不復雜。在檢測基因組突變位點方面，可能由于測序樣本有限，S100A1基因5 個外顯子不存在SNP 位點，隨著樣本數增加，有可能檢測到存在的SNP 位點。同時，SNP 位點也可能出現在內含子上，進而影響其發揮作用。雖然實驗沒有檢測到S100A1基因外顯子存在突變位點，但其他結果表明S100A1基因參與小尾寒羊脂肪細胞形成與發育。S100A1基因在脂肪細胞中發育的具體功能值得進一步探究。

4 結 論

S100A1基因CDS 序列285 bp，編碼94 個氨基酸，分子量為10.52 ku，為酸性親水穩定蛋白，主要在細胞質中發揮作用。實驗證實了小尾寒羊S100A1基因在不同細胞分化階段及不同日齡脂肪組織差異表達。雖然小尾寒羊S100A1基因CDS 序列以及外顯子不存在突變，但仍然值得深入研究其在脂肪代謝上的功能。