腸道分節絲狀菌對宿主腸黏膜免疫系統的影響及其在模式動物中的研究進展

鐘奇祺，張海波，黎力之，廖曉鵬，關瑋琨*，郭冬生*

（1.宜春學院生命科學與資源環境學院，江西省高等學校硒農業工程技術研究中心，宜春市功能農業與生態環境重點實驗室，江西宜春 336000；2.宜春學院繼續教育學院，江西宜春 336000）

腸道分節絲狀菌（Segmented filamentous bacteria，SFB）自1849 年被發現并取名為“enteric flora”后，采用16S rRNA 基因序列分析法進行鑒定證實其為不同于梭菌亞屬的一個新亞屬，命名為“Segmented filamentous bacteria[1-2]。SFB 作為回腸末端優勢菌，也是最早被報道對宿主先天性免疫和固有性免疫同時產生影響的腸道菌[3]。研究表明SFB 定植對動物腸黏膜免疫建立及腸道環境調控具有重要意義，一方面SFB通過向外伸出獨特鉤狀結構與腸上皮細胞（Intestinal Epithelial Cells，IECs）緊密結合，使抗原借道IECs向CD4+T 細胞呈遞，刺激其向輔助性T 17（T Helper 17，Th17）細胞分化，完善腸內免疫機制[4-5]；另一方面，Th17 細胞所產生白細胞介素（Interleukin，IL）-17 與IL-22 協同促進β-防御素2 表達，保證腸道屏障結構與功能的完整性[6]。此外，SFB 促進IgA+B 細胞增殖，同時腸腔IgA 也高效作用于SFB 與IECs 結合位點，防止SFB 異常擴增，所以腸道SFB 與IgA 產生存在反饋調節[7-8]。目前關于SFB 與宿主腸黏膜免疫系統間相互作用的系統綜述較為缺乏。因此，本文基于SFB 最新研究進展，重點闡述SFB 與Th17 細胞、IgA+B 細胞和固有淋巴細胞（Innate Lymphoid Cells，ILCs）的互作關系，并就SFB 在模式動物中的研究進行綜述，為指導動物健康養殖提供理論參考依據。

1 SFB 簡介

1.1 SFB 形態及生命周期 SFB 定植時形態發生改變，產生鉤狀突起作為細絲伸長點助力錨定，選擇性黏附于宿主IECs[9]。SFB 附著IECs 后，細絲向遠端生長分裂，隨長度增長菌體內壁逐漸增厚至形成4 層細胞壁，同時中部開始內陷逐漸靠攏形成隔，將內膜包被小體分成不對稱兩小節，稱為次級未分化細胞[10]。一旦次級未分化細胞分化為子細胞與母細胞，母細胞便將子細胞吞噬容納，子細胞在其中又將分化為2 個細胞后代，隨細絲擴散或形成孢子釋放[11]。在適宜條件下，菌體內陷隔便降解形成管狀結構，將細胞運送至宿主腸道內分散定植，開始新一輪黏附增殖；但非適宜條件時，后代細胞在母細胞內包裹肽聚糖后變為該宿主內缺乏定植能力的內生孢子，隨糞便排出，直至外界適宜條件出現，水平傳播給下一宿主，完成SFB 生命周期[12]。

1.2 SFB 代謝特征 對小鼠和大鼠SFB 分離物進行基因組測序后，發現皆為1.5～1.62 Mbp 的小基因組，含1 350～1 400 個蛋白質編碼基因和低水平的G+C，序列內容與梭狀芽胞桿菌屬高度相似，二者最大區別在于糖利用途徑不同[13]。SFB 基因組具有非氧化戊糖磷酸和葡萄糖轉化為丙酮酸糖酵解途徑的完整基因，但缺少有氧呼吸所必需的三羧酸循環途徑的絕大多數基因[14]。當腸上皮表面SFB 定植位點上出現低氧時，SFB 將啟動精氨酸酶與過氧化氫酶基因的表達，形成自我保護[10]。研究證實，SFB 存在極嚴重的營養缺陷，喪失幾乎所有氨基酸（除賴氨酸）、維生素及輔酶因子的合成能力，完全依賴生存環境的供給維持自身[15]。此外，SFB 對鐵的需要量異常強烈，其自身無法合成鐵載體，但SFB可編碼3 種鐵攝取調節劑驅動周圍細菌的鐵載體，控制其他細菌中鐵含量[16]。因此，SFB 代謝對腸內環境存在高度依賴性，印證其對IECs 緊密黏附的必要性，而這樣的黏附作用又在SFB 抗原呈遞刺激腸道免疫建立時發揮重要作用。

2 SFB 與動物腸黏膜免疫細胞的互作

2.1 SFB 與腸內Th17 細胞的互作 在抗原刺激下固有層CD4+T 細胞特異性增殖分化為Treg 細胞、濾泡輔助性T 細胞和Th17 細胞等不同亞群[17]。轉錄因子維甲酸受體的相關孤立受體γt 分泌IL-17A、IL-17F 和IL-22為Th17 細胞出現的特征，Th17 細胞出現后可有效保護宿主免受細菌和真菌感染，維持腸黏膜免疫穩態[18-19]。研究證實，SFB 陽性小鼠腸內Th17 細胞數量及IL-17水平顯著高于SFB 陰性小鼠，可知SFB 影響Th17 細胞增殖及IL-17 分泌量[20-22]。SFB 不僅能生成特異性產物，對抗原呈遞方式也存在選擇。Goto 等[23]為證明SFB 誘導Th17 細胞增殖對主要組織相容性復合體 II（Major Histocompatibility Complex-II，MHC-II）的 依賴性，選用H2-Ab-/-小鼠（存在MHC-II 缺陷）移植野生型小鼠的CD4+T 細胞和SFB 菌株，結果顯示小鼠體內存在高水平CD4+T 細胞，SFB 成功定植腸道，Th17細胞數量卻明顯低于野生型小鼠。探究MHC-II 各類表達細胞后，發現除CD11c+細胞外小鼠腸內樹突狀細胞（Dendritic Cells，DCs）不同亞群（CD11b+CD103+、CD11b-CD103+等）的耗竭對固有層中Th17 細胞水平不造成影響[22,24]。由此可見，腸道DCs 的MHC-II基因表達對于SFB 介導的Th17 細胞增殖具有重要作用。Yi 等[25]分別將源于大鼠和小鼠的SFB 定植于無菌小鼠體內，發現大鼠來源的SFB 促進Th17 細胞分化能力遠低于小鼠，后續試驗表明，其定植結果與缺乏黏附能力的SFB 變異株一致，說明SFB 的黏附能力是觸發宿主CD4+T 細胞信號轉導的關鍵。SFB 伸出鉤狀結構與IECs 產生緊密連接，出現獨特的微生物黏附引發的內吞作用（Microbial Adhesion Triggered Endocytosis，MATE），更利于抗原捕獲進行抗原呈遞[21]。MATE 形成特有囊泡結構以獲取SFB 細胞壁上以蛋白P3340 為主的抗原物質進入IECs，通過IECs 內體-溶酶體網絡運送至細胞基底層，誘使血清淀粉樣A 蛋白（Serum Amyloid A，SAA）產生，其中SAA1 與SAA2 高度表達作用于固有層CD11c+細胞，提高IL-6 和IL-23 分泌量，刺激幼稚CD4+T 細胞向Th17 細胞方向分化[21,26]。綜上所述，SFB 利用獨特黏附作用定植于宿主IECs，特異選擇抗原呈遞方式，誘導機體Th17 細胞增殖，維持黏膜穩態（圖1）。SFB 可促進動物Th17 細胞增殖，加強宿主對致病菌及SFB 本身的防御。研究表明，IL-17 受體（IL-17 Repoter，IL-17R）可直接調控α-防御素、Nox1（一種NADPH 氧化酶）和多聚免疫球蛋白（Polymeric Immunoglobulin Receptor，pIgR）受體基因表達水平，是限制SFB 及其他病原菌異常擴增的關鍵因子之一，其中IL-17A、IL-17F 與IL-17R 結合后抑菌作用最為顯著[27-28]。研究證明，IL-17A 和CXCR2 依賴的中性粒細胞在SFB 及其他致病菌急速擴張時向回腸募集，致使SFB 及致病菌數量明顯降低，黏膜屏障完整性得以維持[26,29]。因此，SFB 與Th17 細胞的相互作用利于機體腸黏膜免疫防御建立，保障腸道健康，但SFB 異常擴增觸發IL-17R 作用后導致SFB 數量下降，是針對SFB 自身的反向調節，還是抑制其他病原菌增殖而引發的SFB 數量協同降低，需進一步求證。

圖1 SFB 與腸內Th17 細胞的互作

2.2 SFB 與IgA+B 細胞的互作 分泌型免疫球蛋白（Secretory Immunoglobulin A，sIgA）釋放主要發生在派爾集合淋巴結（Peyer's Patches，PPs）。將單定植SFB 或大腸桿菌的小鼠進行對比，發現兩類小鼠PPs 數量差別不大，但是SFB 定植小鼠出現明顯較大的PPs 生發中心，產生高濃度誘導配體（Proliferation Inducing LIgAnd，APRLI）和B 細胞活化因子（B Cell Activating Factor，BAFF），B220+IgA+B 細胞水平在細菌定植20 d 后激增達到頂峰，刺激宿主淋巴濾泡和三級淋巴組織形成，糞便sIgA 濃度與活性均顯著提高[30-31]。此外，除誘導IgA 產生外，SFB 還促使IECs 中pIgR 釋放，利于IgA 通過上皮進入腸腔發揮作用[32]。

SFB 誘導產生IgA 存在負反饋調節，防止SFB 過度定植[15]。Macpherson 等[33]研究發現，腸道B 細胞缺乏IgA 類抗體轉化開關——胞嘧啶核苷脫氨酶（Activationinduced Cytidine Deaminase，AID），且IgM合成不受影響時，小鼠腸道內SFB 異常迅速擴增，進行重組IgA 反應后B220+IgA+B 細胞數目回到正常水平，隨后SFB 數量急劇下降，表明只有IgA 能夠解開SFB與IECs 的附著，而IgM 并不可以。腸腔IgA 將SFB高度包被，抑制其直接接觸腸壁，無法黏附IECs，失去定植能力，維持機體腸道屏障的完整性，抵御其他病原微生物入侵[32]。綜上，SFB 誘導產生IgA 可協助腸道環境穩定，維護機體健康（圖2），但其對SFB 的作用如何異于其他免疫球蛋白仍需進一步探究。

圖2 SFB 與IgA+B 細胞的互作

2.3 SFB 與ILCs 的互作 ILCs 是參與宿主固有免疫反應的淋巴細胞，分為ILC2、ILC3 等，常見于黏膜屏障部位，局部微環境改變后，接收免疫應答信號分子（如IL-7、IL-23 等），促使細胞因子（如IL-22、INF-γ）及其他介質分泌，產生免疫監視和免疫調節作用，其中ILC3 被認為是腸道IL-22 的主要分泌者[32,34]。IL-22 能有效刺激巖藻糖基轉移酶2 表達和上皮巖藻糖基化，誘導IECs 衍生抗微生物分子（如RegIIIγ、抗菌肽等），抵御病原菌入侵上皮系統，維持黏膜免疫穩態[35-37]。SFB 誘導IL-22 是通過其定植后產生IL-23 間接進行，IL-23R 在ILC3 上發出信號，釋放IL-22，故IL-23R/IL-22 軸系出現缺陷導致SFB 異常增殖[38]。研究表明，將大鼠SFB 定植于缺乏SFB 的小鼠后，IL-22 恢復正常水平，揭示SFB 促進ILC3 釋放IL-22。

ILC3 通過依賴STAT3 的IL-22 信號觸發SAA 釋放，增強Th17 細胞分化，對SFB 定植產生影響。研究顯示，將SFB 定植于芳香烴受體缺陷小鼠，ILC3 基本生物學功能無法維持，導致IL-22 水平降低，SFB 數量異常增加，促使Th17 細胞增殖[42]。但Zhu[43]指出，ILC3 和IL-23R/IL-22 軸系抑制Th17 細胞反應，這與軸系限制共生細菌誘導特異性CD4+T 細胞反應的能力有關。因此，SFB 通過Th17、IECs 和IL-23R/IL-22 軸系等組成的動態網絡對ILCs 產生作用，那么深入探究各細胞和因子間關系，可為進一步揭示SFB 影響ILCs 的分子機制提供理論依據。

3 SFB 在模式動物腸道免疫中的研究現狀

SFB 定植后具有抵御鼠傷寒沙門氏菌和檸檬酸桿菌入侵宿主的能力[44-45]。Lai 等[46]對不同年齡的小鼠腸道進行監測發現，SFB 定植的腸段不再出現沙門氏菌，SFB 未定植的部位發現沙門氏菌，同時將SFB 移植至感染腸致病性大腸桿菌O103（enteropathogenic Escherichia coli 103，REPEC O103）的家兔模型發現，SFB 穩定存在后REPEC O103 無法引起相應病癥。腸道SFB 不僅幫助動物抵抗病原菌侵襲，還增強動物防御腸道寄生蟲的能力。Burgess 等[47]研究發現，痢疾變形蟲感染SFB單定植小鼠模型后，其腸內中性粒細胞數量顯著上升，使宿主免受侵害。Edelblum 等[45]研究發現，剛地弓形蟲感染小鼠在SFB 定植后觸發腸道通透性補償增加，產生大量IL-17A 抑制病原體易位。SFB 異常擴增可介導產生劇烈的Th17 反應，誘使IL-17 過度產生觸發炎性腸病[48]。Jia 等[49]試驗顯示，葡聚糖硫酸鈉誘導結腸炎的小鼠體內IL-17A、SFB 含量激增，使用蛋殼膜粉治療后，SFB 數量顯著降低，菌群多樣性恢復，抑制Th17 細胞過度表達，有效緩解結腸炎。此外，小鼠患重度聯合免疫缺陷癥移植CD4+T 細胞恢復后，將SFB+SPF 菌群混養定植腸內才能誘發小鼠結腸炎，并伴隨SFB 數量增多；而SFB 單定植一段時間后數量下降，SPF 菌群定植卻未出現病理變化，表明SFB 異常擴增導致結腸炎，且依賴腸內其他共生菌產生輔酶因子（乙酰輔酶A、核黃素等）維持自身需要[25]。綜上所述，SFB 定植于模型動物腸道對提高腸道菌群豐富度、阻止病原體危害宿主、維持腸道免疫具有重要意義，但SFB的異常增殖也會導致機體發生腸道炎癥，調控SFB 水平可為未來治療腸道炎癥提供新方向。

4 結 語

SFB 定植在模式動物試驗中被證實與腸黏膜免疫具有積極的互作效應，主要與Th17 細胞、IgA+B 細胞及ILCs 發生作用。錨定于IECs 上的SFB，向Th17 細胞抗原呈遞，促使IL-17 分泌，阻止病原菌入侵上皮，同時IL-17R 的調控作用使腸內SFB 水平保持穩定，維持良好的腸道環境。SFB 刺激IgA+B 細胞增殖，使腸內sIgA 維持較高水平，可特異解除過度增殖SFB 對IECs的黏附，反向控制SFB 定植，并靶向清除其他致病菌，進而預防疾病發生。此外，SFB 可間接促進ILC3 分泌IL-22，完善IL-23R/IL-22 軸系，加速腸黏膜免疫系統的建立。然而，腸道免疫為一復雜網絡系統，在SFB與宿主交互作用下對免疫是否造成其他影響尚無定論，故利用更為全面的分析手段深入探討SFB 對動物體作用的分子機制，更有助于確定其在維護腸道健康和疾病預防方面的有益作用，為指導動物健康養殖提供理論參考依據。現有的研究成果顯示，SFB 獨特的黏附方式是其與動物體發生積極互作效應的基礎，但SFB 菌株具有多樣性，不同動物間SFB 存在差異，且不同菌株定植能力有強弱之別，而目前多數研究仍集中進行于一類試驗動物上，關于畜禽SFB 的研究鮮有報道，因此建立SFB 體外分離純培養探究純培SFB 在其他動物體是否發揮相同作用為今后的研究方向之一，同時也需要更多基礎試驗為后續發展提供理論依據。