光學(xué)相干成像技術(shù)無創(chuàng)監(jiān)測Er:YAG激光消融后人牙本質(zhì)表面變性層

曾素娟，藍銀濤，高偉健，黃文燕，舒 焱，葛立宏*，張 建*

（1. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院兒童口腔科，廣州市口腔再生醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點實驗室，廣州 510182；2. 廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系，廣州 511436）

1997 年，摻鉺釔鋁石榴石（Er:YAG，簡稱“鉺”）激光獲得食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準，作為牙體硬組織的激光應(yīng)用于臨床。其波長為2 940 nm，在水及羥基磷灰石OH-的吸收峰附近。水吸收激光能量后瞬間汽化，體積劇烈膨脹，產(chǎn)生微爆破，從而達到去除組織的效果［1］。由于齲壞組織的含水量高于健康組織，Er:YAG 激光能選擇性地去除齲壞組織。與傳統(tǒng)渦輪機相比，其在牙體預(yù)備過程中不接觸組織、無震動、噪聲小，對硬組織有鎮(zhèn)痛作用，使患者更舒適，減少患者的焦慮，尤其適用于牙科恐懼癥的患者［2］。Er:YAG 激光消融硬組織建立在光熱機械作用的基礎(chǔ)上。在使用Er:YAG 激光時，不應(yīng)忽視牙體硬組織熱損傷的危險。熱分析研究顯示，有機成分、水分子和碳酸鹽在300℃以下即可發(fā)生熱改性［3］。無機和有機成分的變化可影響牙體硬組織的滲透性、溶解性或黏附性［4］。深入研究受激光影響的牙本質(zhì)，特別是表面下層的結(jié)構(gòu)特性，有利于指導(dǎo)臨床口腔醫(yī)生為激光處理后的牙本質(zhì)選擇合適的粘接方法，進而提高修復(fù)效率。大部分傳統(tǒng)評估熱損傷的方法，如組織學(xué)和掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM），屬于破壞性的檢測，需進行樣品脫鈣、脫水、切片等，處理步驟繁瑣且需消耗大量的樣本以及成本［5-6］，不能直接應(yīng)用于臨床病例。因此有必要開發(fā)一種能夠?qū)崟r和無創(chuàng)評估牙本質(zhì)特征的監(jiān)測工具。

光學(xué)相干層析成像（optical coherence tomography，OCT）是一種實時、無創(chuàng)、高分辨率的光學(xué)成像手段。其信號對比度源于生物組織或材料光學(xué)反射（散射）特性的空間變化，可以快速形成包含樣本斷面結(jié)構(gòu)的二維或三維影像［7-10］。在牙科領(lǐng)域中，OCT 已被應(yīng)用于隱匿齲、牙齒-充填體復(fù)合界面完整性和牙齒裂紋等的檢測［11-13］。在組織結(jié)構(gòu)一致的前提下，OCT 圖像呈現(xiàn)出相同的灰度值。樣品對光的折射率隨著組織結(jié)構(gòu)變化而變化，OCT 圖像隨之顯示出不同的灰度值，從而揭示出不同的生物學(xué)特性［14］。基于這一理論，本研究應(yīng)用OCT分析短脈沖Er:YAG 激光照射后牙本質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化情況，并與組織學(xué)進行比較。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)備

鉺-釹雙波長激光器（Fotona，斯洛文尼亞，美國）；正置顯微鏡（DM4，Leica，Wetzlar，德國）；SEM（S-3 400N II，Hitachii，日本）；X射線能量色散譜（energy dispersive X-ray，能量色散X 射線光譜儀（energy dispersive X-ray spectroscopy，EDX），550i，IXRF Sytems，Austin TX，美國）。

1.2 處理樣本

本試驗樣品為因阻生拔除的完整的人類第三磨牙，離體牙納入的標準為無齲壞、無氟斑、無釉質(zhì)發(fā)育不全和非四環(huán)素牙。拔牙后用手工潔治器刮除牙體上的軟組織和色素，置于1%氯胺T 溶液4℃中保存。使用高速渦輪機金剛砂車針在水噴霧下去除冠部釉質(zhì)層，暴露中層牙本質(zhì)，用320、800、1 200、2 500 目砂紙在流水下拋光60 s，在30 倍體視顯微鏡下觀察，確保無釉質(zhì)殘留；棄去表層有裂紋的牙塊，從釉牙骨質(zhì)界下2 mm 處切斷牙根，去除牙髓，超聲波振蕩清洗20 min，得到牙本質(zhì)圓盤，置于0.9%生理鹽水中室溫下保存，1 周內(nèi)用于試驗。本項目已通過廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理會審查（倫理審批編號：KY2019002）。

1.3 試驗分組

將牙本質(zhì)圓盤隨機分為6 組，每組10 個樣本，分組如下：1）砂紙組 經(jīng)1.2 方法處理后的牙本質(zhì)圓盤即為砂紙組。2）球鉆組 高速渦輪機上金剛砂球鉆在水冷卻下切削牙本質(zhì)表面。每5 次預(yù)備后更換新的球鉆。3）Er:YAG 激光組 試驗光源為Er:YAG激光，脈沖頻率為0～50 Hz（可調(diào)），激光光束通過關(guān)節(jié)臂傳輸后經(jīng)透鏡直接聚焦于組織樣品上，光斑直徑為1.3 mm。激光消融參數(shù)：能量為100 mJ，頻率為20 Hz，脈沖寬度為50 μs。在連續(xù)水噴霧下，在距靶點1.0 mm 的非直接接觸模式下用R14 型手持設(shè)備進行激光傳輸，移動激光手具切削牙本質(zhì)表面。4）砂紙+酸蝕組 將樣品吹干，去除多余的水分，37%磷酸蝕刻30 s，水霧沖洗30 s。5）球鉆+酸蝕組 按球鉆組中的方法處理牙本質(zhì)表面后，37%磷酸蝕刻30 s，水霧沖洗30 s。6）激光+酸蝕組 按Er:YAG 激光組中的方法處理牙本質(zhì)表面后，37%磷酸蝕刻30 s，水霧沖洗30 s。

樣品表面處理完畢后，每組隨機抽取樣件分別進行后續(xù)檢測。

1.4 光學(xué)相干層析成像技術(shù)檢測

牙本質(zhì)表面處理完成后，通過OCT 系統(tǒng)獲取處理后牙本質(zhì)表面的截面圖。試驗所用的OCT系統(tǒng)的中心波長λ0=840 nm，帶寬Δλ=40 nm，功率P=5 mW，橫向和軸向分辨率約為7.24 μm。圖1 為本研究使用的定制的譜域光學(xué)相干層析成像（spectral-domain optical coherence tomography，SD-OCT）系統(tǒng)。

1.5 牙本質(zhì)病理切片制備及蘇木精-伊紅化學(xué)染色

將OCT 檢測后的牙本質(zhì)樣本浸入4%多聚甲醛中固定48 h，流水下沖洗過夜；經(jīng)乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）脫鈣液浸泡21 d，流水下沖洗4 h 后脫水，并用石蠟包埋。每個石蠟包埋標本均切成4 μm 連續(xù)切片。將切片烘干后，用二甲苯脫蠟、加入梯度乙醇直至水化，再用蒸餾水清洗，然后進行蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，H&E）染色，中性樹脂封片。將切片正置顯微鏡下觀察并拍攝照片。

1.6 SEM 及X 射線能量色散譜檢測

圖1 本研究中使用的SD-OCT成像系統(tǒng)（a）和牙本質(zhì)盤（b）Fig. 1 SD-OCT imaging system (a) used in this study and the photograph of a dentin plate (b)

樣品經(jīng)常規(guī)固定、干燥、噴金，用SEM 分析牙本質(zhì)組織微結(jié)構(gòu)變化，放大倍數(shù)為1 000、3 000，加速電壓為15 kV。用安裝在SEM 上的EDX 檢測消融牙本質(zhì)元素的組成，每個樣本隨機選取3～4 個激光照射區(qū)域和正常牙本質(zhì)組織區(qū)域，測定鈣（Ca）、磷（P）元素的含量（單位：atomic percentage，at %），并計算鈣磷比例。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究的試驗數(shù)據(jù)采用One-Way ANOVA 分析及Kruskal-Wallis 檢驗，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

在OCT 圖像上，所有試驗組牙本質(zhì)表層光散射特性均發(fā)生改變，可見高亮層形成，光強度隨著深度的加深而減弱，牙本質(zhì)表層及下層組織呈現(xiàn)出不同的灰度值（圖2），表層組織具有較淺的灰度（較高的散射強度），下層組織的灰度值較暗（較低的散射強度），表明牙本質(zhì)表層與下層組織的結(jié)構(gòu)特性發(fā)生了改變。組織學(xué)結(jié)果表明：激光組牙本質(zhì)表層有不規(guī)則邊界的連續(xù)薄變化層（被蘇木精深染，嗜堿性），沒有明確的結(jié)構(gòu)；球鉆組牙本質(zhì)表面可觀察到不連續(xù)的薄變化層；經(jīng)砂紙?zhí)幚淼难辣举|(zhì)表面光滑，染色最淺。H&E 染色觀察到的薄染色層與OCT表面的高亮層結(jié)果一致。

定量結(jié)果（圖3、4）顯示，受Er:YAG 激光影響的牙本質(zhì)改性層厚度明顯高于砂紙和球鉆組（P＜0.05），表明Er:YAG 激光誘導(dǎo)的牙本質(zhì)變性程度強于其他兩組。在空氣和組織折射率不同的基礎(chǔ)上，OCT 測量的組織厚度大于其實際值，但兩者間存在顯著的正線性相關(guān)性［14］。經(jīng)過一系列的數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，可以計算得出牙本質(zhì)修飾層的真實厚度。

圖2 牙本質(zhì)組織的OCT 圖像（左）和相應(yīng)的組織學(xué)圖像（右）Fig. 2 The OCT images (left) and the corresponding histological images (right) of dentin tissue

圖3 OCT強度分布圖Fig. 3 The OCT intensity profile

基于Er:YAG 激光切削硬組織的光熱及光蝕理論，Er:YAG 激光切削可能導(dǎo)致牙本質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化［15］，從而導(dǎo)致OCT 圖像中高亮層的出現(xiàn)。關(guān)于受激光影響的牙本質(zhì)深度，霍曉等［6］和Ceballos等［15］通過投射電鏡（transmission electron microscope，TEM）分析發(fā)現(xiàn)Er:YAG 激光照射后牙本質(zhì)表面形成了3～5 μm 厚的修飾層。在光學(xué)顯微鏡研究中，Almehdi 等［16］觀察到激光處理后牙骨質(zhì)表面形成了深染的嗜堿性層，而在球鉆處理后的組織表面未見深染的嗜堿或嗜酸性層。該作者推測表面變性層是由激光熱效應(yīng)引起的。據(jù)報道，選擇適當(dāng)?shù)腅r:YAG 激光參數(shù)有助于降低牙本質(zhì)組分的熱效應(yīng)。與傳統(tǒng)評估牙本質(zhì)表面下層性質(zhì)的方法相比，OCT具有非電離、無創(chuàng)、實時、重復(fù)性好等優(yōu)點［5-6］。由此可見，OCT 技術(shù)可輔助臨床醫(yī)生選擇合適的Er:YAG 激光參數(shù)，減少臨床中不必要的熱損傷。然而，值得注意的是，通過OCT 圖像無法解釋不同灰度層相對應(yīng)的組織結(jié)構(gòu)［5］。為了進一步研究受影響層的耐酸性能，指導(dǎo)臨床磷酸蝕刻時間，本研究接下來進行了SEM 和EDX 光譜分析。

SEM 結(jié)果（圖5）顯示：激光組的牙本質(zhì)表面呈鱗片狀不規(guī)則形態(tài)，無玷污層，牙本質(zhì)小管開放，呈袖口狀突出；磷酸處理后，牙本質(zhì)小管開口擴大，未見明顯的膠原纖維網(wǎng)暴露；砂紙組及球鉆組的牙本質(zhì)表面可見玷污層覆蓋，牙本質(zhì)小管封閉；磷酸處理后，牙本質(zhì)表面無玷污層，牙本質(zhì)小管呈漏斗狀開放，膠原纖維網(wǎng)暴露。

EDX 結(jié)果（表1）顯示：激光+酸蝕組的鈣含量、磷含量在所有酸處理組中最高（P＜0.05），這表明激光處理后的牙本質(zhì)變得更耐酸；砂紙組及球鉆組間鈣、磷含量均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。所有試驗組間鈣磷比例無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），表明牙本質(zhì)的羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）晶體未發(fā)生變性或重建。

圖4 OCT 圖像上的牙本質(zhì)高亮層的厚度結(jié)果Fig. 4 The thickness of the layer with high image intensity generated on the dentin in the OCT analysis

由于HA 晶體中鈣和磷原子的比例是相對恒定的［4］，根據(jù)Ca/P 的比值可推測HA 的晶體結(jié)構(gòu)。據(jù)文獻報道，Er:YAG 激光能量密度低于7 J/cm2時，牙齒表面最高溫升約有300℃［17］。在本研究中，激光輸出能量劑量（1.88 J/cm2）較低，硬組織的表面溫升小于300℃，這可以解釋牙本質(zhì)HA 晶體為何未發(fā)生變性和重建。有文獻報道，激光改性牙本質(zhì)的變化主要包括碳酸鹽含量的降低和結(jié)晶度的提高，這可能會增加輻照底物對酸的耐受性［18］。He 等［19］同樣觀察到，當(dāng)每單脈沖100 mJ 的Er:YAG 激光照射牙本質(zhì)后，牙本質(zhì)的耐酸性增加。本研究的結(jié)果與He 等先前報道的研究結(jié)果一致。

3 討論

牙本質(zhì)由有機組分和無機組分組成，其中無機組分主要是HA 晶體中的鈣和磷。激光照射后生物組織的化學(xué)改變很大程度上取決于其成分的性質(zhì)。SEM 結(jié)果表明，Er:YAG 激光組與球鉆組間鈣、磷含量及鈣磷比例無統(tǒng)計學(xué)差異，但磷酸處理同樣時間后，球鉆組鈣、磷含量顯著低于激光組，這說明激光組的牙本質(zhì)表面變得更耐酸。Esteves-Oliveira 等［20］發(fā)現(xiàn)，Er:YAG 激光處理后牙本質(zhì)碳磷比降低，表面變得更穩(wěn)定、更耐酸。Ramos 等［21］發(fā)現(xiàn)Er:YAG 激光處理后牙本質(zhì)膠原纖維變性融合，間隙縮小，這影響了磷酸接觸牙本質(zhì)，阻礙了粘接劑滲透至脫礦全層，導(dǎo)致全酸蝕粘接組粘接強度低于自酸蝕組。

圖5 牙本質(zhì)表面的SEM圖Fig. 5 SEM of treated dentin surfaces

表1 酸處理前后牙本質(zhì)表面元素的平均值±標準差（原子百分比，at%）Tab. 1 ±s of dentin surface elements before and after acid treatment (atomic percentage, at%)

表1 酸處理前后牙本質(zhì)表面元素的平均值±標準差（原子百分比，at%）Tab. 1 ±s of dentin surface elements before and after acid treatment (atomic percentage, at%)

注：不同小寫字母表示不同組間的結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。Note: Different lowercase letters indicate significant differences in the results among different groups (P＜0.05).

Elements Sandpaper-treated group Er:YAG laser plus acid treated group Ca 19.22±2.91 a 20.01±2.90 a 18.97±2.96 a 7.07±1.30 b 7.58±1.18 b 14.67±1.93 c P 16.32±2.37 a 16.80±2.71 a 16.31±1.88 a 6.33±1.04 b 6.87±1.03 b 12.66±1.32 c Ca/P 1.20±0.11 a 1.19±0.11 a 1.18±0.11 a 1.12±0.08 a 1.11±0.06 a 1.16±0.10 a Bur-treated group Er:YAG laser-treated group Sandpaper plus acid treated group Bur plus acid treated group

軸向分辨率和成像深度是決定厚度測量準確性的關(guān)鍵參數(shù)。本研究所用的OCT 系統(tǒng)的軸向分辨率約為10 μm，對牙本質(zhì)的成像深度超過250 μm，病理切片顯示深染層的厚度范圍是30～50 μm，因此本研究的OCT 系統(tǒng)可以準確測量Er:YAG 激光消融牙本質(zhì)后表面變性層的厚度。OCT 結(jié)果顯示，所有試驗組牙本質(zhì)表層光散射特性均發(fā)生改變，可見高亮層形成，光強度隨著深度的加深而減弱。定量結(jié)果表明，受Er:YAG 激光影響的牙本質(zhì)層厚度明顯高于球鉆組和砂紙組，說明Er:YAG 激光導(dǎo)致的牙本質(zhì)變性作用強于球鉆切削及砂紙拋光。OCT 圖像中不同的灰度值被認為是由于光從空氣傳到組織時折射率的差異造成的［13］。Er:YAG 激光的光熱機械消融作用可能使牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致OCT 圖像上不同厚度的改性層出現(xiàn)。組織學(xué)結(jié)果顯示，激光組牙本質(zhì)表層有不規(guī)則邊界的連續(xù)嗜堿性薄變化層，而球鉆組未見牙本質(zhì)表層或形成不連續(xù)的薄變化層，改性層結(jié)果與OCT 光強變化結(jié)果一致。同樣，Ishizaka 等［22］通過H&E 染色發(fā)現(xiàn)，激光處理的牙本質(zhì)表面有一層嗜堿性深染層，而球鉆處理后牙本質(zhì)表面未見深染層。與組織學(xué)相比，OCT 技術(shù)可實時無損地定量表征牙本質(zhì)表層性狀的改變，兩種方法得到的改性層厚度有一定的相關(guān)性和一致性。

總之，本研究結(jié)果表明，使用OCT 技術(shù)可實時無損地定量表征牙本質(zhì)表層性狀的改變，其效果相當(dāng)于傳統(tǒng)的組織病理切片。經(jīng)過一系列的數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換可得到牙本質(zhì)修飾層的厚度。盡管激光處理后的牙本質(zhì)的HA 晶體結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變，但激光處理后的牙本質(zhì)變得更耐酸。從臨床的角度來看，這些信息將有助于牙醫(yī)確定粘接修復(fù)策略。在今后的研究中，應(yīng)深入研究激光對牙齒表層的結(jié)構(gòu)損傷及牙體硬組織性質(zhì)的影響，以確定牙本質(zhì)粘接修復(fù)的最佳方法。