過表達TNFAIP1促進替莫唑胺對人腦膠質瘤細胞U251遷移和侵襲的抑制作用

許斐鈺，陳 果，龍勝文，魏晨曦

（湖南師范大學生命科學學院，長沙 410081）

關鍵字：人腦膠質瘤；TNFAIP1；TMZ；細胞侵襲；EMT

人腦膠質瘤是中樞神經系統中最常見的腫瘤，其發病率占全部原發腦腫瘤的40%以上，且具有很強的侵襲性和破壞性，預后差，復發率高，治療方法有限［1-2］。人腦膠質瘤患者的治療模式包括手術后聯合放療和化療。替莫唑胺（temozolomide，TMZ）是一種烷化劑抗腫瘤藥物，能使DNA 的核苷酸甲基化并導致甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉移酶（O-6-methylguanine DNA methyltransferase，MGMT）異常，致使細胞中DNA 錯配修復系統無法正常作用，故常被用于輔助治療腦膠質瘤。然而TMZ 通常只對缺乏MGMT 的患者有益，并且腦膠質瘤標準治療后復發往往不可避免，最終導致膠質瘤患者的死亡率很高，這對醫生和患者來說是一個不容樂觀的現實［3-6］。TMZ 雖然對治療腦膠質瘤有一定的作用，但是也伴隨耐藥的發生。上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是最初在胚胎發育過程中觀察到的一個過程。在此過程中，細胞失去上皮特征而獲得間充質特性，從而增強了遷移性和侵襲性，這一過程在腫瘤的進展和轉移中也很重要［7］。最近的研究表明，EMT 與化療耐藥密切相關，阻斷EMT 通路可消除肺癌對抗葉酸化療的耐藥性［8］。在結腸直腸癌和胰腺癌中也發現了同樣的結果［9-10］。因此，闡明膠質瘤細胞中遷移和侵襲的分子機制和發現新的靶點可能是了解膠質瘤對TMZ耐藥的關鍵。

腫瘤壞死因子α 誘導蛋白1（tumor necrosis factor α-induced protein 1，TNFAIP1）也被稱為B12 或BACURD2，最早在臍靜脈內皮細胞中被發現，可被腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNFα）和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導表達［11］，其氨基酸序列含有保守的BR-C、TTK、BTB/Pox virus、zinc finger （POZ） domain 及增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）結合位點［12］。大量研究表明，TNFAIP1 對細胞的遷移、侵襲、凋亡和免疫應答都有影響，且TNFAIP1 的異常表達與多種疾病的發生相關，包括乙型肝炎病毒感染、神經性疼痛、阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）等［13-17］。最新研究表明，TNFAIP1 的異常表達在藥物引起的神經毒性［18］和肝癌細胞的轉移和致瘤性［19］中起關鍵性作用，然而TNFAIP1 在人腦膠質瘤中的作用和潛在機制卻暫無報導。因此，本研究在U251 細胞中過表達TNFAIP1 后，聯合TMZ 處理，觀察U251細胞的遷移和侵襲能力的變化，并初步探討其機制，為臨床治療人腦膠質瘤提供新的策略和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人腦膠質瘤細胞系U251 和大腸桿菌菌種E.coliTOP 10 由本實驗室保存；pCMV-Myc 質粒（Clone-tech 公司，美國）；pCMV-Myc-TNFAIP 1 表達載體由實驗室構建保存。TMZ（Sellect公司，美國）；RNA Trizol 提取試劑（Takara 公司，日本）；用于內參檢測的微管蛋白Tubulin、甘油醛-3-磷酸脫氫酶蛋白（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（Sigma公司，美國）；Myc-Tag抗體（武漢三鷹公司）；TNFAIP1、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin和Snail 抗體（ABclonal 公司，美國）；辣根過氧化物酶偶聯的羊抗兔、羊抗鼠二抗（KPL Technologies 公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

細胞培養液為含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的高糖培養基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）培養液。細胞于10 cm 的皿中培養，并置于條件為37℃、5%CO2、飽和濕度恒溫的細胞培養箱中，長至對數生長期時用于試驗。

1.2.2 脂質體轉染

根據LipofectamineTM2000 轉染試劑說明書操作，本試驗以6 孔板為例，待細胞長至 70%～80%開始轉染，吸掉舊培養液，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗1次，加入2 mL DMEM，放入37℃細胞培養箱中。分別取100 μL opti-MEM稀釋脂質體和質粒DNA（脂質體和質粒DNA 的體積比例為2∶1），室溫靜置5 min。將稀釋好的DNA在渦旋振蕩器上滴加到脂質體中，振蕩10 s 后室溫靜置30 min。將200 μL DNA/脂質體混合物滴加到事先饑餓處理的細胞中，前后左右輕輕晃動培養板，混合均勻后放入37℃細胞培養箱，4 h 后，換成含有血清和抗生素的培養液繼續培養24 h。

1.2.3 藥物處理

細胞在10 cm 培養皿中長至90%以上后，以細胞數量為2×106個鋪板于6 孔板中，每孔加2 mL細胞培養液。15～24 h 后，待細胞在6 孔板中長至90%以上時吸去舊培養液，開始加藥。設置對照組0.01%的二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），試驗組分別加 0.1、0.2、0.3 mmol/L TMZ（為避免血清的干擾，藥物處理時培養基均不含血清），處理36 h。

1.2.4 細胞劃痕試驗

將細胞接種至6 孔板中，長至90%時吸去舊培養液，按1.2.2 脂質體轉染和1.2.3 藥物處理的步驟對細胞進行處理。藥物處理36 h 后用純DMEM 洗凈舊培養液，進行劃痕試驗。用10 μL 槍頭劃痕，槍頭垂直于孔板平面，力度一樣，目的是為了讓傷口寬度保持一致。1 個6 孔板可沿直徑劃2 次。劃痕完后用純DMEM 洗凈漂浮的細胞3 次，后加入2 mL細胞培養液放入細胞培養箱中繼續培養，48 h 后取出，再用純DMEM 洗2 次后拍照，統計劃痕傷口愈合情況并分析其遷移率。

1.2.5 Transwell細胞侵襲試驗

將細胞鋪至6 孔板中，長至70%～80%時按1.2.2 脂質體轉染和1.2.3 藥物處理的步驟對細胞進行處理。藥物處理36 h 后用0.2%胰酶對細胞進行消化，取2×104個細胞鋪于事先放置在24 孔板的小室的上室中（體積總量為200 μL），下室加入600 μL 含15%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的培養基，每個組設置3 個重復。置于細胞培養箱中培養48 h 后，將小室從24 孔板中取出，PBS 洗2 次，用干凈的棉簽輕輕地刮去小室內部的細胞。注意避免接觸小室下部，防止拭去侵襲過去的細胞。隨后用4%的多聚甲醛固定30 min，PBS 洗3 次。最后用0.5%結晶紫染色液染色20 min，用PBS 輕輕淋洗小室數次至結晶紫染液洗凈，置于室溫干燥后在顯微鏡下拍照，統計從上室侵襲至下室的細胞個數并分析其侵襲率。

1.2.6 Western blot

用0.2%胰酶消化收集細胞，視細胞的量加入細胞裂解液RIPA lysis buffer（6 孔板每孔細胞加150 μL 裂解液），于冰上放置30 min 進行裂解，1 400 r/min 離心5 min 之后抽提細胞全蛋白，用5%的濃縮膠和12%的分離膠進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），電泳結束后將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，三乙醇胺緩沖液鹽水溶液-吐溫-20（triethanolamine buffered saline solution-Tween-20，TTBS）洗4 次，每次10 min，分別加入TNFAIP1、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、Snail、Tubulin 和GAPDH 抗體，4℃孵育過夜。次日，TTBS 洗4 次，每次10 min，后加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗兔或羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h 后TTBS 洗4 次，每次10 min，加ECL（electrochemiluminescence）顯影液，在全自動凝膠成像系統中曝光顯影。

1.3 試驗數據統計分析

采用Image J 及Graph Pad Prism6 軟件分析作圖。試驗數據用統計軟件IBM SPSS 22 進行分析，以平均值±標準差表示，兩組間比較采用單因素方差分析和t檢驗來確定組間差異的顯著性，P＜0.05為有差異統計學意義。

2 結果與分析

2.1 TMZ抑制U251 細胞的遷移與侵襲

為了研究TMZ 對U251 細胞遷移與侵襲的影響，本試驗用0.1、0.2、0.3 mmol/L TMZ 處理U251 細胞36 h，采用細胞劃痕法及Transwell 試驗分別檢測藥物處理后U251細胞遷移與侵襲能力的變化，發現TMZ 以劑量依賴的方式抑制了U251 細胞的遷移和侵襲，如圖1a～1d 所示。這些數據表明，TMZ 具有以劑量依賴的方式抑制U251 細胞的遷移和侵襲的能力。

2.2 TMZ上調U251 細胞TNFAIP1 的表達

為確定TMZ 是否會影響U251 細胞內TNFAIP1的表達，本試驗分別用0.1、0.2、0.3 mmol/L 的TMZ處理U251 細胞36 h，然后分別提取總RNA 和總蛋白。半定量PCR 試驗結果表明，隨著TMZ 濃度的升高，TNFAIP1 的mRNA 表達上調，如圖2b 所示。Western blot 試驗進一步表明，隨著TMZ 濃度的升高，TNFAIP1 的蛋白表達量上調，如圖2a 所示。這說明用TMZ 處理U251 之后上調了內源TNFAIP1 的表達。

2.3 過表達TNFAIP1促進TMZ對U251細胞遷移與侵襲的抑制作用

為了探討TNFAIP1 是否參與TMZ 對U251 遷移與侵襲的抑制，本試驗把轉染空載質粒pCMVMyc 組設為對照組，把過表達TNFAIP1 組（Myc-TNFAIP1）、添加TMZ 0.3 mmol/L組（pCMV-Myc＋TMZ 0.3 mmol/L）、TMZ 0.3 mmol/L ＋過表達TNFAIP1 組（Myc-TNFAIP1＋TMZ 0.3 mmol/L）設為試驗組。過表達TNFAIP1 及0.3 mmol/L TMZ 單獨處理均可抑制U251 的遷移與侵襲，但TMZ 0.3 mmol/L ＋過表達TNFAIP1 聯合作用對U251 遷移與侵襲的抑制顯著大于過表達TNFAIP1和0.3 mmol/L TMZ單獨處理組，如圖3a～3d所示。這說明TNFAIP1可促進TMZ對腦膠質瘤的殺傷作用。

圖1 不同濃度TMZ 對U251 細胞遷移和侵襲能力的影響Fig. 1 Cell migration and invasion levels in U251 cells exposed to different concentration of TMZ

圖2 不同濃度的TMZ 對TNFAIP1表達影響的分析Fig. 2 TNFAIP1 expression in U251 cells exposed to different concentration of TMZ

2.4 TNFAIP1 通過EMT 通路抑制U251 細胞的遷移與侵襲

試驗最后研究了TNFAIP1 是否通過EMT 通路抑制U251 細胞的遷移與侵襲。當在U251 細胞中過表達TNFAIP1 和用0.3 mmol/L 的TMZ 單獨處理時，與對照組相比，上皮分子標志物E-cadherin 的表達分別上調37.1%、31.6%（P＜0.01）；間質細胞分子標記物N-cadherin分別下調20.7%、33.7%（P＜0.01）；Vimentin 分別下調4.5%（P＜0.05）、34.6%（P＜0.01）；Snail 分別下調3.5%（P＜0.05）、19.3%（P＜0.01）。而在過表達TNFAIP1 及添加0.3 mmol/L TMZ 聯合作用組中，上皮分子標記物E-cadherin 的蛋白表達比較于對照組上調46.4%（P＜0.01），間充質細胞分子標記物N-cadherin、Vimentin、Snail 的表達則分別下調44.3%、52.9%、33.4%（P＜0.01），具體如圖4a～4c所示。這表明TNFAIP1 能通過EMT 通路參與TMZ對U251 細胞遷移與侵襲的抑制作用，從而減緩腫瘤惡化的發展速度。

圖3 過表達TNFAIP1促進TMZ 對U251細胞遷移和侵襲的抑制Fig. 3 Changes in the effects of TMZ on U251 migration and invasion before and after TNFAIP1 overexpression

圖4 Western blot檢測過表達TNFAIP1對EMT信號通路的影響Fig. 4 Effect of TNFAIP1 over-expression on EMT signaling pathway detected by Western blot

3 討論

人腦膠質瘤，特別是級別高的人腦膠質瘤患者的預后通常很差，傳統治療方法已無法有效提高其治愈率和存活率。目前治療方案主要是以手術治療為主，術后輔助放療和化療，其常用化療藥物為TMZ。TMZ 雖然目前被認為是在開發新的臨床神經膠質瘤靶向藥物之前最為有效的治療劑，但是用其治療后的高復發率及患者預后不良等局限性仍不容小覷。人腦膠質瘤的化療耐藥是一個復雜的過程，必須從多因素、多基因、多機制中共同探討其潛在的耐藥機制［20-22］。TNFAIP1 在人類、小鼠、大鼠和線蟲中都有一個極其進化保守的單拷貝基因，且其在DNA 合成和細胞凋亡過程中的重要作用、在AD 尸檢患者的大腦中的上調表達、異常表達對小鼠來源神經瘤母細胞（mouse neuroblastoma N2a cells，N2A）的影響等報導比比皆是［23-28］，證明了其在神經性膠質瘤中可能存在重要作用。但TNFAIP1在人腦膠質瘤的TMZ耐藥性中的作用卻尚無報導。

為了探索TNFAIP1 是否在TMZ 抑制人腦膠質瘤遷移及侵襲過程中存在作用，本試驗用TMZ對U251 細胞進行藥物處理。與已發表的研究相似，TMZ 具有以劑量依賴的方式抑制U251 細胞的遷移和侵襲的能力［1，5，20］。之后，我們提取藥物處理U251 細胞后的總RNA 及總蛋白，分析發現TNFAIP1 的轉錄及蛋白表達水平均呈現上調趨勢。這表明TNFAIP1 可能參與了TMZ 對U251 細胞遷移及侵襲抑制的過程。此前我們實驗室已經證明TNFAIP1是一個抑癌基因［18-19，26，28］，而TMZ 上調U251細胞中TNFAIP1 的表達，所以我們選擇過表達TNFAIP1。試驗數據表明，相較于只用TMZ和只過表達TNFAIP1，過表達TNFAIP1 聯合TMZ 對U251 細胞遷移及侵襲的抑制作用明顯增強。這說明過表達TNFAIP1 能聯合TMZ 促進對人腦膠質瘤遷移和侵襲的抑制作用。

臨床上認為癌細胞的侵襲轉移是腫瘤不良預后的主要原因，大量文獻報導，EMT 是腫瘤細胞獲得強侵襲及轉移能力的重要進程之一。EMT 是上皮細胞失去極性而重組細胞骨架，進而轉變成具有遷移能力的間質表型的過程。該過程與多種上皮和間充質基因的轉錄水平改變有關。且有研究表明，化療藥物常抑制EMT 的進展［29-32］。EMT 也被認為是卵巢癌、肝癌等腫瘤侵襲和轉移的中心機制［33-34］。EMT 中上皮分子標志物E-cadherin 的下調是關鍵環節，已有研究發現了一些能夠抑制E-cadherin 表達的轉錄因子，包括Snail、Slug、Twist 及E47蛋白［35］。且EMT 中間充質標志物蛋白的表達增加能使上皮細胞表現出多種間充質細胞的特質，從而導致細胞的運動能力和侵襲性增加［33，36］。試驗數據表明，相較于只用TMZ 和只過表達TNFAIP1，過表達TNFAIP1 聯合TMZ 使EMT 的過程受到抑制，表現為上皮分子標志物E-cadherin 表達上調，間質細胞分子標記物N-cadherin、Vimentin 和Snail 表達下調，這表明TNFAIP1 能通過EMT 通路抑制U251 細胞的遷移與侵襲。

綜上所述，我們的研究說明TMZ 不僅能抑制U251 的遷移與侵襲能力，同時能升高TNFAIP1 的表達。過表達TNFAIP1 可以促進TMZ 對人腦膠質瘤細胞U251 遷移與侵襲的抑制，表明TNFAIP1作為一個抑癌基因在TMZ 抑制U251 遷移、侵襲過程中發揮了重要作用，因此TNFAIP1 可以作為臨床治療人腦膠質瘤耐藥的潛在生物標志物和潛在的藥物靶點。但TNFAIP1 參與U251 對TMZ 耐藥的具體過程及分子機制仍需進行更深入的研究。