基于生物信息學方法分析EGLN1在腎透明細胞癌中的表達及意義

姚宇同，劉 巖，戴 露，夏彬彬

（錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科，錦州 121000）

腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是全世界范圍內常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一。2018 年的癌癥統(tǒng)計數據顯示，全年新診斷為RCC 的患者約40 萬人，其中約17.5 萬人死亡［1］。其中腎透明細胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是RCC中最常見的一種病理類型，占全部RCC 的65%～85%。由于RCC 對放療及化療不敏感，故目前仍以手術治療為主。RCC 早期多無明顯的臨床表現及體征，往往就診時已經發(fā)生轉移，而轉移性RCC 手術難度大且預后較差，因此，研究RCC 的關鍵基因對RCC 的診斷、治療及提示預后具有重大價值。

egl-9 家族缺氧誘導因子1（egl-9 family hypoxia inducible factor 1，EGLN1，又稱PHD2）是一種存在于生物機體中的氧敏感因子，通過感知細胞組織內的氧含量的情況調控其下游基因的表達，進而影響如葡萄糖攝取、代謝調節(jié)、血管生成、細胞周期等重要生理過程［2］。有研究表明，EGLN1的表達情況與大腸癌［3］、子宮內膜癌［4］、乳腺癌［5］、肺癌［6］等多種惡性腫瘤事件的發(fā)生及預后具有密切關系。目前ccRCC 中EGLN1表達的臨床意義尚不明確，本文應用生物信息學的方法，綜合分析EGLN1在ccRCC中的表達情況，為臨床中ccRCC 的診斷、治療及預后評估提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 數據來源和方法

基于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA，https://portal.gdc.cancer.gov），下載ccRCC患者的基因表達數據［530 例，癌組織樣本539 例（存在1 枚病理提取數條樣本的可能），癌旁正常腎組織樣本72 例］。從該數據中提取全部EGLN1基因的表達情況并進行整理分析，使用R（v3.6.1）中l(wèi)imma及beeswarm程序包繪制EGLN1表達散點差異圖。

使用在線分析平臺UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）分析ccRCC 中EGLN1基因在病理分期、腫瘤分級、患者年齡、淋巴結轉移狀態(tài)、組織亞型等角度的表達情況。

基于TCGA 數據庫中ccRCC 的臨床信息數據（537 例，表1）中EGLN1基因的表達情況進行其與總生存率的相關性單因素及多因素Cox分析。

基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）是一種針對全基因組表達譜芯片數據的分析方法。以京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）為背景，根據EGLN1所有的基因表達量進行統(tǒng)計分析，了解EGLN1在各個代謝通路中的高低表達組中的差異。

表1 TCGA ccRCC患者的特征Tab. 1 Characteristics of ccRCC patients in TCGA

功能蛋白互作網絡（STRING，https://string-db.org/）［7］是包含已知和預測的蛋白質相互作用的數據庫，包括從基因組分析、高通量試驗及共表達研究中獲得的物理和功能的關聯(lián)。應用STRING（v11.0）數據庫獲取EGLN1 來自智人（Homo sapi-ens）的蛋白質互作網絡圖，并了解EGLN1存在的共表達基因，通過在線平臺基因表達譜交互式分析網站（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA，http://gepia.cancer-pku.cn/）進行相關分析。

1.2 統(tǒng)計學分析

圖1 EGLN1在TCGA數據庫中的基因表達情況Fig. 1 EGLN1 gene expression in the TCGA database

應用R（v3.6.1）對ccRCC臨床病例數據中EGLN1的表達量與總生存期進行單因素及多因素Cox 回歸分析。統(tǒng)計檢驗采取雙邊檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。GSEA中符合|NES|＞1、NOM p-val＜0.05及FDR q-val＜0.25 的富集結果為差異具有統(tǒng)計學意義。（NES為標準化富集分數；NOM p-val為標準化顯著性水平；FDR q-val為矯正多重假設檢驗）。

2 結果與分析

2.1 EGLN1 的表達差異

使用R（v3.6.1），安裝limma和beeswarm程序包，于TCGA 數據庫下載截止于2019 年8 月ccRCC 數據中的EGLN1基因表達樣本（530 例，癌組織樣本539例，癌旁正常腎組織樣本72例）。應用UALCAN在線分析平臺分析ccRCC中EGLN1在患者年齡、病理分期、腫瘤分級、淋巴結轉移狀態(tài)及組織亞型等角度的表達情況（圖1）發(fā)現，在所有樣品中，EGLN1在ccRCC組織中的表達明顯高于癌旁正常組織。另外，EGLN1 的表達量隨年齡的增長而增加。同時，EGLN1 的表達量與腫瘤的分級和分期成反比，這表明EGLN1基因可能對腫瘤的惡性進展有抑制作用。

2.2 生存分析

提取TCGA數據庫中所有ccRCC樣本中（537例，表1）EGLN1基因的表達數據，根據表達差異分為高表達組和低表達組，應用R（v3.6.1）對罹患ccRCC患者的生存率進行描繪（圖2）。可見EGLN1高表達組患者生存率高于低表達組，且P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。

圖2 EGLN1在ccRCC患者高低表達組的生存差異Fig. 2 Survival difference of EGLN1 between high and low expression groups of patients with ccRCC

2.3 EGLN1 表達量與總生存期相關Cox分析

將ccRCC 患者臨床數據樣本中EGLN1的表達量與總生存期進行單因素及多因素Cox 回歸分析發(fā)現，ccRCC 患者癌組織中EGLN1的表達量是患者生存期的獨立風險因素。由表2 和圖3 可知風險比（hazard ratio，HR）為0.93，95%置信區(qū)間（95% confidence interval，95%CI）為0.90～0.97，P為0.000 08。

表2 ccRCC患者EGLN1表達量與總生存期相關性的單因素及多因素Cox回歸分析Tab. 2 Univariate and multivariate Cox regression analysis of the correlation between EGLN1 expression and overall survival in patients with ccRCC

圖3 ccRCC患者EGLN1表達量與總生存期多因素Cox分析Fig. 3 Multivariate Cox analysis of EGLN1 expression and overall survival in patients with ccRCC

2.4 基因GSEA 富集分析

為了解EGLN1基因在ccRCC 中參與的生物過程和信號通路，本研究將539 例癌組織樣本按EGLN1表達量的中位值［每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的碎片（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，FPKM）=19.725］分為高表達組及低表達組進行基因GSEA 富集分析（number of permutations：1 000，|NES|＞1，NOM p-val＜0.05，FDR q-val＜0.25）。結果顯示，EGLN1的高表達與前列腺癌、子宮內膜癌、胰腺癌、RCC、小細胞肺癌、甲狀腺癌、大腸癌等惡性腫瘤密切相關，同時在癌癥途徑、泛素介導蛋白水解途徑、細胞凋亡通路中也呈高表達型（圖4、5）。此外，EGLN1在心肌收縮通路中呈低表達型。

2.5 構建蛋白質互作網絡

圖4 EGLN1在各途徑的表達情況Fig. 4 The expression of EGLN1 in each pathway

為進一步了解基因EGLN1在人體內的功能機制，本研究應用STRING 數據庫構建了EGLN1 相關功能蛋白質互作網絡。由圖6 可知，共有20 種預測的功能蛋白與EGLN1 相互作用。其中有4 種相關蛋白基因已被證實與ccRCC 的發(fā)生和進展有關。von Hippel-Linda 腫瘤抑制因子（von Hippel-Lindau tumor suppressor，VHL）具有泛素連接酶E3 活性，參與缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）的泛素化及降解，進而影響其下級通路［如血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）等轉錄的增加］，由此促進惡性腫瘤的進展［8］。已有研究表明，絕大多數ccRCC 中均發(fā)生了VHL 的失活［9］。低氧誘導因子1A 亞基（hypoxia inducible factor 1 subunit alpha，HIF1A）的過表達會激活多種致癌信號通路，或使腫瘤抑制因子失活，其升高多發(fā)生在癌癥早期，通常與腫瘤的惡性進展、預后差及對放化療的低敏感度有關［10］。雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的過度表達可能促進腎臟癌變，其所存在的mTOR 通路的過度激活被認為是RCC 發(fā)生的標志［11］。同時，mTOR 的過表達也被認為是多種癌癥的不良預后因素［12］。叉頭盒O3（forkhead box O3，FOXO3）被認為是一種抑癌基因，參與細胞增殖、細胞程序性死亡等細胞生理過程的調節(jié)［13］。在RCC 組織中，miR-122 可直接靶向FOXO3以起到促進腫瘤生長的作用［14］。通過在線網站GEPIA 分析發(fā)現EGLN1與VHL、HIFIA、mTOR、FOXO3 的表達均呈正相關（P＜0.05）（圖7）。

圖5 EGLN1基因相關富集分析（細胞凋亡、心機收縮通路、大腸癌、子宮內膜癌、胰腺癌、癌癥通路、前列腺癌、RCC、小細胞肺癌、甲狀腺癌、泛素介導蛋白水解途徑）Fig. 5 EGLN1 gene-related enrichment analysis (apoptosis, cardiac muscle contraction pathway, colorectal cancer, endometrial cancer,pancreatic cancer, pathway in cancer, prostate cancer, RCC, small cell lung cancer, thyroid cancer, ubiquitin-mediated proteolytic pathway)

圖6 構建EGLN1相關蛋白質互作網絡Fig. 6 Construction of EGLN1 related protein interaction network

圖7 EGLN1相關性分析Fig. 7 EGLN1 correlation analysis

3 討論

缺氧環(huán)境發(fā)生于多種實體惡性腫瘤事件這一發(fā)現已成為國內外研究的焦點。腫瘤細胞會根據缺氧環(huán)境發(fā)生一系列生物學變化來應對組織缺氧，如凋亡受限、血管的異常增殖、耐藥等。EGLN 家族屬于亞鐵和2-氧戊二酸雙加氧酶家族，作為生物細胞組織中的氧感受器調節(jié)著生物機體內的氧穩(wěn)態(tài)。其家族之一的EGLN1 的主要作用即在常氧情況下將HIF1A 羥基化，并通過募集VHL 將其靶向降解［15］。而在乏氧時，EGLN1 活性降低，HIF1A 降解受限并不斷積蓄，導致了控制血管生成、葡萄糖代謝、增殖、侵襲及轉移等基因的轉錄［16］。由此可見，EGLN1的表達情況很有可能潛移默化地影響著腫瘤的發(fā)生及進展。

EGLN1在不同的癌組織中的作用不盡相同，甚至其表達水平會出現截然相反的情況。在宮頸癌的相關研究中，EGLN1在宮頸上皮內瘤變組織和癌變組織中的陽性表達呈升高趨勢［17］。相關試驗證明，隨著宮頸病變程度的增加，EGLN1 蛋白和其mRNA 水平上調，這表明EGLN1表達高低與宮頸病變嚴重程度呈正相關。在乳腺癌中，EGLN1 與表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在低氧環(huán)境中的相互作用可能增強了腫瘤的進展和轉移［18］。而最近也有研究表明，EGLN1低表達水平的乳腺癌患者的生存時間明顯縮短，表明該基因可能存在抗腫瘤作用［18］。同樣，肝細胞癌中EGLN1 的高水平與腫瘤分期更高、腫瘤尺寸更大以及患者總體生存狀況較差有關［19］。EGLN1 高表達的肺腺癌患者的總生存期（overall surviva，OS）及無復發(fā)生存期（relapse free survival，RFS）顯著縮短，提示預后不良［20］。Di 等［3］研究發(fā)現，在缺氧狀態(tài)下，mTOR 通路會抑制P70S6K 的活性，進而釋放PP2A/B55α 信號，P70S6K 的下調以及PP2A /B55α 磷酸酶活性的相互上調導致EGLN1 的去磷酸化及部分失活，最終促進HIF1A 的穩(wěn)定。

本研究整理TCGA 數據庫發(fā)現，EGLN1 在ccRCC中高表達，這與EGLN1 在多種其他惡性腫瘤中的表達相一致。在整理分析EGLN1 表達情況與病理結果時發(fā)現，該基因的表達量隨年齡的增長而增加，結合多因素Cox 回歸分析結果，提示老齡是罹患ccRCC 的高危風險之一。同時，在較高分期及分級的病理組織中，EGLN1 的表達量反而呈下降趨勢。其影響ccRCC 惡性程度的機制可能是：在腫瘤組織內，EGLN1 表達下調及HIF1A 的上調加劇了缺氧微環(huán)境，激活了血管生成相關刺激因子［21］，大量異型血管形成，為腫瘤組織提供了豐富血供的同時也促進了腫瘤的生長和侵襲。此外，低氧環(huán)境亦可通過PHD2-HIF1A 驅動機制調節(jié)癌癥相關成纖維細胞（cancer associated fibroblast，CAF）誘導的基質重塑和癌細胞侵襲［22］。這也間接說明EGLN1 的高表達可能對腫瘤的惡性進展有著抑制作用。多因素Cox 分析顯示，EGLN1 的表達量是ccRCC 患者的獨立風險因素，提示EGLN1 的表達水平可能會影響ccRCC 患者的預后情況。將TCGA 數據庫中ccRCC 患者總體生存率與EGLN1 高低表達進行分析，發(fā)現EGLN1 低表達的患者生存率較差，這使得EGLN1 有望成為我們評估ccRCC 的預后指標。我們利用STRING 構建EGLN1 蛋白功能互作網絡預測出20 種功能蛋白與EGLN1 相互作用，其中的4 種與ccRCC 的發(fā)生與進展相關。進一步應用GEPIA 數據庫對它們進行Spearman 分析發(fā)現，EGLN1與HIF1A、VHL、mTOR、FOXO3 的表達情況可能相互作用推動著ccRCC 的發(fā)生進展。通過富集分析發(fā)現，EGLN1 在RCC、癌癥途徑、泛素介導的蛋白水解途徑及細胞凋亡通路中均呈高表達型。同時結合UALCAN 分析平臺分析ccRCC 發(fā)現，隨著腫瘤分期及分級的升高，EGLN1 的表達量呈下降趨勢，提示EGLN1 在ccRCC 中可能抑制著腫瘤的惡性進展。Liu 等［23］研究發(fā)現，EGLN1 的缺失會導致AKT-mTOR 信號通路的激活，并與致癌性B-Raf 原癌基因（B-Raf proto-oncogene，BRAF）的協(xié)同作用可增加原發(fā)性皮膚黑色素瘤（skin cutaneous melanoma，SKCM）的淋巴結轉移能力。

本研究利用TCGA 數據庫樣本及生物信息學方法分析驗證了EGLN1在ccRCC 臨床樣本中的表達情況，隨后進行ccRCC 患者生存分析及總生存期相關Cox 分析，提出EGLN1可能是ccRCC 中潛在的抑癌因素。生物信息學分析是使用計算機系統(tǒng)收集和分析大量生物數據的技術，缺少試驗數據支持驗證，存在一定的局限性。未來可以從臨床角度對EGLN1與腫瘤病理類型、腫瘤病理分級、術后預后的關系進行分析驗證，也可以從基礎的角度敲低EGLN1后研究ccRCC 細胞系的侵襲遷移情況。EGLN1在ccRCC 發(fā)生與進展中的具體機制及生物學作用仍等待進一步研究。