肺炎支原體的病原生物學(xué)研究進(jìn)展

劉 瑤，廖國(guó)陽(yáng)*

（1. 昆明醫(yī)科大學(xué)，昆明 650550；2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明 650118）

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）是一種能夠引起呼吸道感染的人類病原體［1］。據(jù)報(bào)道，支原體科支原體屬基因組是由普通革蘭氏陽(yáng)性菌祖先經(jīng)過(guò)減少基因組的方式進(jìn)化而來(lái)的［2］。在自然界中已經(jīng)鑒定出200 多種支原體，但只有少數(shù)幾種被證實(shí)可導(dǎo)致人類疾病，其中最重要的是MP。據(jù)統(tǒng)計(jì)，MP 可導(dǎo)致所有年齡段人群中高達(dá)40%的社區(qū)獲得性肺炎（community-acquired pneumonias，CAP），并可引起地區(qū)性流行［3］，在所有人群中普遍易感，其中對(duì)老人、兒童及免疫力低下人群危害更為嚴(yán)重。MP 感染不僅能引起發(fā)熱、干咳等臨床癥狀，還可引發(fā)多種并發(fā)癥［4］，造成機(jī)體多系統(tǒng)損傷［5］，如哮喘、慢性阻塞性肺疾病等［6］。與其他種類的呼吸道病原體不同的是，盡管付出了巨大的努力，但肺炎支原體的疫苗仍無(wú)法獲得［7］。

1 病原學(xué)特征

MP 呈單個(gè)紡錘形細(xì)胞，長(zhǎng)1.0～2.0 μm，寬0.1～0.2 μm，二分裂方式繁殖，一般1～6 h分裂1代，可通過(guò)0.22 μm 的微孔濾膜，反復(fù)傳代后，顯微鏡下觀察菌落呈油煎蛋狀（圖1）［8］。MP 的基因組片斷大小為816 394 bp，含730 個(gè)編碼基因，約為大腸桿菌的1/6。MP 的基因組包含大量重復(fù)區(qū)域，稱為RepMP，約75%的RepMP與MPN141（P1）和MPN142（P40/P90）具有同源性。根據(jù)P1 蛋白上RepMP2/3和RepMP4重復(fù)序列的不同，MP 可分成M129型（I型）和FH 型（Ⅱ型）［9］。RepMP與MPN141或MPN142之間的同源重組可在P1 或P40/P90 的抗原區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生變異，是MP 逃避免疫宿主系統(tǒng)監(jiān)視的重要策略［10］。MP 的基因組小，生物合成能力有限，不能自主合成固醇類物質(zhì)。其分離培養(yǎng)對(duì)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分要求較高，常以牛心消化液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入酵母粉及動(dòng)物血清混合制備。MP 對(duì)pH較為敏感，最適pH 為7.5～8.0，低于7.0 易死亡，且耐冷，在-70℃或液氮中菌株可被長(zhǎng)期保存，在4℃保存不宜超過(guò)3 d。自然環(huán)境下，MP 需依賴宿主細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)生存，脫離宿主會(huì)迅速死亡，對(duì)于干燥的敏感性證實(shí)其只能通過(guò)飛沫傳播［8］。

2 致病機(jī)制

MP 的運(yùn)動(dòng)性和傳染性由免疫顯性蛋白P1 和P40/P90 形成的被稱為“Nap”的跨膜黏附復(fù)合物所介導(dǎo)［11］。目前研究表明，MP 的致病機(jī)制主要是感染后對(duì)宿主細(xì)胞的直接作用及引起機(jī)體的免疫病理?yè)p傷。

2.1 細(xì)胞黏附機(jī)制和分子機(jī)理

MP 對(duì)呼吸道細(xì)胞的黏附是其致病的主要原因，其與宿主上皮組織之間的緊密聯(lián)系是導(dǎo)致疾病的前提，通常缺乏黏附能力的MP 也缺乏致病力。MP 的黏附作用是由其頂端極化的黏附細(xì)胞器結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的（圖2）［12］。MP 的黏附作用和滑行運(yùn)動(dòng)由主要抗原蛋白P1 決定，其在呼吸道黏膜上的黏附和運(yùn)動(dòng)可被抗P1 抗體阻止［13］。P1 是與宿主細(xì)胞的唾液酸寡糖受體結(jié)合的主要抗原［14］。隨著研究的深入，Krause 等［15］還證實(shí)了MP 的黏附功能也需要其他輔助蛋白［高分子量（high molecular weight，HMW）、P40、P65 蛋白等］及分子伴侶蛋白（TopJ、Lon 蛋白等）的參與。P1 被認(rèn)為是MP 細(xì)胞中免疫力最強(qiáng)的蛋白質(zhì)之一，在感染患者的免疫反應(yīng)、診斷以及流行病學(xué)研究中起著重要作用［16］。P30 蛋白的作用與P1 蛋白相似，缺失會(huì)導(dǎo)致MP 的黏附功能喪失［8］。P40/P90 由MPN142基因編碼的130 kD的蛋白水解切割得到的兩個(gè)多肽組成［17］。研究顯示，盡管P1 和P40/P90 大小不同，但兩種蛋白的緊密關(guān)系表明二者具有最近的共同系統(tǒng)發(fā)生祖先［18］。除Nap 成分以外的蛋白質(zhì)，P30、P41、P65、HMW1、HMW2 和PrpC/PrkC 對(duì)于MP 在上皮細(xì)胞表面的黏附作用和滑行運(yùn)動(dòng)也十分重要。研究顯示，P41 和P24 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中附著細(xì)胞器裝配的正確時(shí)機(jī)和位置至關(guān)重要。若缺少P41，滑行過(guò)程中黏附細(xì)胞器會(huì)與自身胞體發(fā)生分離［19］。HMW 蛋白能維持和穩(wěn)定黏附細(xì)胞器的正常結(jié)構(gòu)，保證P1、P30 蛋白的聚集、活化和黏附等過(guò)程正常進(jìn)行。P90蛋白與P40 蛋白能將P1 蛋白錨定于黏附細(xì)胞器的細(xì)胞骨架上。

圖1 肺炎支原體的顯微鏡照片F(xiàn)ig. 1 Microscopic view of Mycoplasma pneumoniae

圖2 黏附細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)模式圖Fig. 2 Structure of attachment organelle

除黏附損傷外，MP 感染產(chǎn)生的過(guò)氧化物會(huì)造成機(jī)體損傷。在遠(yuǎn)源生物絲狀支原體絲狀亞種SC型（Mycoplasma mycoidessubsp.mycoidessmall colony，MmmSC）的研究中已經(jīng)闡明了致病性與過(guò)氧化物形成之間的相關(guān)性［20］。MP 代謝甘油會(huì)導(dǎo)致過(guò)氧化物的產(chǎn)生［21］，這表明相同的代謝途徑可能導(dǎo)致肺炎支原體疾病的發(fā)生。此外，MP 產(chǎn)生的超氧陰離子可抑制宿主細(xì)胞中的過(guò)氧化氫酶，從而減少過(guò)氧化物的酶促分解，使宿主細(xì)胞更容易受到氧化損傷［22］。也有研究表明，MP 可通過(guò)對(duì)宿主細(xì)胞乳鐵蛋白的吸收，在細(xì)胞代謝中使鐵呈局部酸性的微環(huán)境，引入鐵絡(luò)合物產(chǎn)生高反應(yīng)性羥基自由基，從而產(chǎn)生局部傷害，其中鐵代謝還包括過(guò)氧化氫和超氧陰離子［23］。除了直接的氧化損傷外，MP 產(chǎn)生的過(guò)氧化氫還可能激活酪氨酸激酶依賴性信號(hào)通路，從而導(dǎo)致免疫系統(tǒng)異常激活［24］。

2.2 MP 與宿主細(xì)胞相互作用和免疫損傷

MP 能掠奪宿主細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行復(fù)制和融合，并分泌細(xì)胞毒素，產(chǎn)生過(guò)氧化氫及超氧化物等，造成細(xì)胞病理?yè)p傷，或引起宿主細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，在不適于MP 生長(zhǎng)的培養(yǎng)液中共同培養(yǎng)Hela 細(xì)胞和MP，MP 可進(jìn)行增殖，而Hela細(xì)胞則發(fā)生病變，提示MP 可通過(guò)掠奪Hela 細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)成分生長(zhǎng)［25］。MP 可進(jìn)入人肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制生長(zhǎng)［26］，從而對(duì)肝臟組織造成傷害。MP 的MPN372基因編碼的毒素蛋白稱為社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征毒素（community acquired respiratory distress syndrome toxin，CARDS TX），與MP 致病力密切相關(guān)，且該蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性。細(xì)胞毒性包括對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞的直接損傷作用［27］，破壞呼吸道黏膜的完整性，使宿主細(xì)胞空泡化。宿主細(xì)胞死亡后釋放胞內(nèi)物質(zhì)，引發(fā)炎癥破壞組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)，產(chǎn)生過(guò)度免疫反應(yīng)［28］。MP的脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白（lipid-related membrane proteins，LAMPs）可通過(guò)TLR-1/2 或TLR-1/2/6 信號(hào)通路活化核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）［29］。在發(fā)酵支原體中已證實(shí)LAMPs 可刺激TLR-2/6，活化NK-κB，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，因此推測(cè)MP 能導(dǎo)致宿主細(xì)胞凋亡或與此相關(guān)［30］。

MP 感染相關(guān)最常見(jiàn)的免疫現(xiàn)象是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。研究顯示，約有5%～15%的格林-巴利綜合征病例與MP 感染相關(guān)［31］。MP 感染也與腦炎、急性脫髓鞘性腦脊髓炎和視神經(jīng)炎的發(fā)生相關(guān)［32］。在一項(xiàng)針對(duì)近2 000 名腦炎患者的研究中，MP 被視為最重要的感染因子［33］，大約5%的病例顯示出急性MP 感染的證據(jù)，其中大多數(shù)為兒童。MP 感染宿主細(xì)胞后可介導(dǎo)吞噬細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子介導(dǎo)非特異性免疫反應(yīng)［34］。被MP 感染的人肺泡II 型肺細(xì)胞顯示，白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、腫瘤壞死因子-a（tumor necrosis factor，TNF-a）和IL-1β mRNA 的產(chǎn)生增加［35］，這表明MP 對(duì)人呼吸道上皮細(xì)胞的黏附會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子的產(chǎn)生及淋巴細(xì)胞和其他炎性細(xì)胞的募集，并且這些細(xì)胞因子隨后會(huì)調(diào)節(jié)炎性浸潤(rùn)的進(jìn)展。由于受到局部損傷，被MP 寄生的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可表現(xiàn)出多種細(xì)胞病變，如使宿主細(xì)胞失去纖毛、出現(xiàn)空泡狀，降低宿主細(xì)胞耗氧量、葡萄糖利用率、氨基酸吸收和大分子合成，最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡。這些局部損傷的臨床表現(xiàn)為如持續(xù)性咳嗽等的急性呼吸道癥狀。MP 被證實(shí)可直接激活免疫系統(tǒng)的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。Kristen等［36］證明，在共培養(yǎng)試驗(yàn)中，MP 可誘導(dǎo)肥大細(xì)胞產(chǎn)生IL-4，這主要取決于靶細(xì)胞膜和P1 黏附素上唾液酸殘基的存在。MP 感染后能直接激活和誘導(dǎo)宿主免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。Yang 等［37］的研究證實(shí)MP ATCC-15531 菌株可直接誘導(dǎo)A549 和U937 細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β。機(jī)體感染MP 后，可產(chǎn)生相應(yīng)組織的自身抗體，形成免疫復(fù)合物激活補(bǔ)體，產(chǎn)生大量中性粒細(xì)胞趨化因子，募集白細(xì)胞引起溶酶體釋放出水解酶，導(dǎo)致破壞性病變及多系統(tǒng)損傷［38］。MP 感染會(huì)引起機(jī)體T 細(xì)胞亞群紊亂，Th1 型細(xì)胞免疫應(yīng)答在MP 感染引起的病理?yè)p傷中起著重要作用［39］。MP 細(xì)胞膜上的糖脂類抗原可誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，CARDS TX 使小鼠產(chǎn)生特異性的IgE，使得哮喘加劇［40］。

MP 感染除誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生一系列特異性和非特異性免疫反應(yīng)外，也會(huì)造成某些自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體損傷。由于MP 和人體存在共同抗原，故其會(huì)引發(fā)機(jī)體自身免疫應(yīng)答，導(dǎo)致多系統(tǒng)免疫損傷和肺外并發(fā)癥［41］。此外，P1 蛋白的抗原多態(tài)性降低了特異性抗體的作用，黏附結(jié)構(gòu)能抵抗纖毛的清除作用，MP 具有的免疫抑制作用和共同抗原的存在使其能逃避宿主的免疫監(jiān)視，不被吞噬細(xì)胞識(shí)別攝取［42］。部分肺炎支原體肺炎（Mycoplasma pneumoniaepneumonia，MPP）患者的T 淋巴細(xì)胞功能暫時(shí)性抑制和對(duì)肺炎鏈球菌等合并感染與此相關(guān)。小鼠感染MP 后，其吞噬細(xì)胞活性和IgG 水平下降，提示MP 具有一定的免疫抑制作用［43］。

3 診斷與治療

MP 感染的診斷方法包括MP 分離培養(yǎng)法、血清學(xué)抗體檢測(cè)法、抗原檢測(cè)法和核酸檢測(cè)法等［44］。MP 感染的病例活檢顯示，MP 患者有黏膜表面的上皮內(nèi)膜潰瘍、支氣管和細(xì)支氣管的纖毛上皮潰瘍、支氣管和支氣管壁水腫等癥狀［45］，可作為MP 的臨床診斷依據(jù)。但MP 感染各組織器官及肺部病變特征不具典型性，因此難以根據(jù)臨床癥狀對(duì)MPP 進(jìn)行確診［45］。早期MPP 臨床診斷常采用冷凝素測(cè)定法。該方法將疑似患有MPP 患者的血液收集于含抗凝劑試管中，冰浴30 s 后傾斜試管檢查凝集現(xiàn)象，但在鑒別診斷中，EB 病毒（epstein-barr virus，EBv）、立克次氏菌、流感病毒和腺病毒等感染也可誘導(dǎo)冷凝集素的產(chǎn)生［46］，因此該方法僅可作為MP 感染的參考。血清學(xué)檢測(cè)是目前國(guó)內(nèi)外最常用的MP 感染診斷方法。培養(yǎng)法是檢驗(yàn)MP 的最佳方法和金標(biāo)準(zhǔn)，但其培養(yǎng)要求高、條件苛刻、耗時(shí)長(zhǎng)，多數(shù)臨檢單位未能建立完整的檢測(cè)體系，常用于回顧性診斷與研究，臨床價(jià)值有限。核酸檢測(cè)法有較好的特異性和靈敏性，可用于MP 感染的早期臨床診斷。Razin等［47］對(duì)各種基于分子手段的MP 診斷方法進(jìn)行了概述。Waites 等［48］對(duì)MP 臨床診斷和藥敏試驗(yàn)的最新方法進(jìn)行了總結(jié)。但由于許多醫(yī)院設(shè)備不全，缺乏質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，使MP 臨床確診仍具挑戰(zhàn)性［49］。

目前臨床上針對(duì)MPP 的治療主要是抗生素治療、纖維支氣管鏡、免疫抑制劑等治療方法［50］。其中主要以大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療為主，對(duì)于急性患者可通過(guò)免疫抑制劑控制炎癥反應(yīng)，纖維支氣管鏡治療能有效檢查肺部局部病變情況。若大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療無(wú)效果，需綜合考慮多種致病因素，進(jìn)行MP 的耐藥性檢測(cè)，從而選擇敏感的藥物進(jìn)行針對(duì)性治療［51］。目前我國(guó)抗大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的MP 耐藥菌耐藥率高達(dá)90%以上，耐藥形勢(shì)十分嚴(yán)峻［52］。因此，MP 疫苗研制是防治MP 感染的有效方案。

4 疫苗研究現(xiàn)狀

早期研究結(jié)果顯示，常規(guī)方法制備的MP 滅活疫苗對(duì)人體具有一定的保護(hù)作用。甲醛滅活的MP 疫苗輔以明礬佐劑注射后可降低肺炎和呼吸道感染的發(fā)生率［53］。但也有研究顯示，人類［54］和小鼠［55］中存在接種MP 疫苗后再次感染加劇病情的情況。陳楓［56］的研究顯示，傳代減毒株疫苗具有一定的保護(hù)效果，且通過(guò)鼻內(nèi)免疫的效果要優(yōu)于皮下免疫接種，提示黏膜免疫提供的免疫保護(hù)在抵御MP 感染中發(fā)揮重要作用。

P1 和P30 抗原是目前MP 基因工程亞單位疫苗的研究熱點(diǎn)。P1 蛋白是MP 表面抗原中目前被認(rèn)為最具潛力的疫苗候選抗原。研究顯示，P1 蛋白編碼基因C'端編碼的蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，但相較于全菌體，其免疫原性低［57］。Vizarraga 等［18］在最新的研究中闡明了MP 中蛋白P1、P40/P90 以及與唾液酸化寡糖結(jié)合的P40/P90 復(fù)合物這些免疫優(yōu)勢(shì)蛋白的抗原結(jié)構(gòu)，其中對(duì)P1 的不同片段的血清學(xué)測(cè)試發(fā)現(xiàn)，IgG 抗體對(duì)保守區(qū)的識(shí)別偏好高于可變區(qū)，表明選擇這些保守區(qū)域進(jìn)行疫苗設(shè)計(jì)是進(jìn)行長(zhǎng)期免疫的系統(tǒng)策略。值得注意的是，其結(jié)果還表明，來(lái)自P1 的C 末端結(jié)構(gòu)域僅包含一個(gè)無(wú)序環(huán)，且沒(méi)有遺傳變異性。此外，P1 的全長(zhǎng)細(xì)胞外區(qū)域被所有血清強(qiáng)烈識(shí)別，而與IgG 或IgM 的比例無(wú)關(guān)，這也證實(shí)了P1 的免疫優(yōu)勢(shì)。這些結(jié)果表明，C 末端結(jié)構(gòu)域可能是一個(gè)相對(duì)較弱或難以接近的抗原區(qū)域，說(shuō)明該區(qū)域能夠有效產(chǎn)生特異性較強(qiáng)的抑制MP 黏附的IgG 抗體，提示該結(jié)構(gòu)域的免疫原性具較高的研究意義。

有研究顯示，即便MP 疫苗在佐劑的作用下具有良好的免疫原性，刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體也并不能為機(jī)體提供有效保護(hù)。另外在注射疫苗完成免疫后，再次感染MP 時(shí)，往往會(huì)出現(xiàn)免疫激化的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致機(jī)體損傷［58］。這些都是目前MP 疫苗研發(fā)過(guò)程中亟待解決的問(wèn)題。

5 總結(jié)與展望

當(dāng)前國(guó)內(nèi)外雖然對(duì)MP 的研究較為深入，但針對(duì)支原體的病原學(xué)研究相對(duì)較少。關(guān)于支原體分離和鑒定標(biāo)準(zhǔn)的制定、菌種庫(kù)的建立、精準(zhǔn)檢測(cè)方法的實(shí)施等的研究對(duì)于MP 感染的診斷十分重要。MP 在所有人群中普遍易感，并可導(dǎo)致兒童重癥肺炎和老年組人群的慢性阻塞性肺炎（chronic obstructive pulmonary disease，COPD），從而危及生命，縮短人均預(yù)期壽命。尤其是對(duì)于MP 耐藥菌株或多重耐藥菌的感染，其臨床治療非常困難。因此目前急需建立針對(duì)MP 感染的早期快速診斷方法。另外，針對(duì)其他動(dòng)物感染的支原體早已有商業(yè)化的疫苗上市，并且得到了廣泛的使用，因此，應(yīng)加強(qiáng)人用新型治療性藥物和安全有效的人用MP 疫苗的研發(fā)。綜上所述，進(jìn)一步深入MP 基礎(chǔ)研究、建立快速可靠的檢測(cè)方法、加強(qiáng)MP 疫苗的研發(fā)對(duì)于MP 的預(yù)防控制及治療刻不容緩。