光遺傳學(xué)在治療神經(jīng)內(nèi)科疾病中的研究進(jìn)展

王運(yùn)茜，薛清萍，馮曦兮，邢國剛，徐 帆*

（1. 成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，成都 610500；2. 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100091）

自2002 年國外有實(shí)驗(yàn)室首次用光受體蛋白來調(diào)控神經(jīng)活動(dòng)取得成功以來，光遺傳學(xué)技術(shù)便迅速地走進(jìn)人們的視野。光遺傳學(xué)是光學(xué)和分子遺傳學(xué)交叉融合的產(chǎn)物，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用于研究各類疾病的發(fā)病機(jī)制與治療方法，其中研究最多的是神經(jīng)功能方面的疾病。近年來，隨著該技術(shù)的發(fā)展，一系列有關(guān)光遺傳學(xué)的科學(xué)研究與相關(guān)技術(shù)應(yīng)用層出不窮。光遺傳學(xué)技術(shù)儼然成為研究神經(jīng)科學(xué)的重要手段。

1 光遺傳學(xué)的發(fā)展簡史

光遺傳學(xué)最早起源于神經(jīng)科學(xué)，是一種利用載體將光敏感蛋白植入可興奮的動(dòng)物神經(jīng)元中，然后光照受體蛋白，從而達(dá)到控制神經(jīng)元、影響生物體生理活動(dòng)的研究方法。

該研究方法萌芽于1979 年。美國著名科學(xué)家克里克（Francis Crick）在Thinking about the brain中提出，在不損傷其他神經(jīng)元的情況下，開發(fā)出一種新的技術(shù)，精確控制特定的大腦神經(jīng)元，以進(jìn)一步開展大腦神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究［1］。2002 年，奧地利神經(jīng)科學(xué)家米森伯克（Gero Miesenb?ck）和其實(shí)驗(yàn)室成員將果蠅的視紫紅質(zhì)基因植入海馬神經(jīng)元標(biāo)本中，再使用光照激活受體蛋白，最后成功控制了神經(jīng)元的活性［2］。這是歷史上體外光控神經(jīng)元取得的首次成功。米森伯克由此被視為光遺傳學(xué)領(lǐng)域的開拓者之一。隨后，《自然神經(jīng)科學(xué)》雜志在2005 年9 月刊登了一篇光遺傳學(xué)領(lǐng)域的開山之作——《毫秒時(shí)標(biāo)，神經(jīng)活動(dòng)的基因靶向光學(xué)控制》。在這篇文章中，研究人員利用光照調(diào)控視蛋白，精確控制了生物體的大腦神經(jīng)元，并且還證實(shí)了植入的光敏感蛋白——通道蛋白視紫紅質(zhì)2（channelrhodopsin-2，ChR2）對細(xì)胞功能無任何損害作用［3］。緊接著，Diesseroth 等［4］為描述此種，將光學(xué)與遺傳學(xué)操作相結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對特定神經(jīng)元活性精準(zhǔn)控制的研究手段，并在2006 年首次提出了光遺傳學(xué)這個(gè)詞語。

光遺傳學(xué)技術(shù)是在光遺傳學(xué)研究上發(fā)展出來的新興技術(shù)。該技術(shù)通過向靶細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入光敏蛋白基因，再利用光纖導(dǎo)入或向大腦內(nèi)植入發(fā)光二極管的方式照射光敏感蛋白，從而實(shí)現(xiàn)對神經(jīng)元的激活或抑制，最后可觀察神經(jīng)電生理的改變［5］。

2 光敏感蛋白的發(fā)現(xiàn)

2.1 細(xì)菌視紫紅質(zhì)（BR）

實(shí)現(xiàn)光遺傳學(xué)技術(shù)的其中一個(gè)關(guān)鍵步驟為光敏感蛋白的發(fā)現(xiàn)和使用。細(xì)菌視紫紅質(zhì)（bacteriorhodopsin，BR）首先被描述為一種單組分跨膜（transmembrane，TM）蛋白，能夠?qū)①|(zhì)子從細(xì)胞內(nèi)空間轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外空間［6］。早在1971 年，Oesterhelt等［7］借鑒青蛙視紫紅質(zhì)的研究方法，首次在古細(xì)菌鹽藻細(xì)胞膜中發(fā)現(xiàn)了視紫紅質(zhì)，因此其又被稱為古細(xì)菌視紫紅質(zhì)。由于在細(xì)菌和動(dòng)物體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了視紫紅質(zhì)，所以其被重新定義為一種動(dòng)物和微生物體內(nèi)含有視網(wǎng)膜生色團(tuán)的光活性蛋白質(zhì)。1973 年，Oesterhelt 等［8］發(fā)現(xiàn)光照BR 能夠引起氫離子外流，從而證實(shí)了其為一種光驅(qū)向外質(zhì)子泵。因其通過光照可改變細(xì)胞膜內(nèi)外電位差，所以BR 可作為光遺傳學(xué)控制靶細(xì)胞的一種工具。

2.2 嗜鹽菌視紫紅質(zhì)（HR）

1977 年，Matsuno-Yagi 等［9］又在古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了嗜鹽菌視紫紅質(zhì)（halorhodopsin，HR），也稱氯視紫紅質(zhì)或鹽細(xì)菌視紫紅質(zhì)。Schobert 等［10］在1982 年發(fā)布的研究表明，HR 是一種由光驅(qū)動(dòng)的氯離子泵，此發(fā)現(xiàn)與之前提出的HR 是一種向外驅(qū)動(dòng)鈉離子泵截然不同。HR 與BR 作用原理相同，均為超極化反應(yīng)，但其吸收560～580 nm 的黃光。光遺傳學(xué)技術(shù)發(fā)展至今，科學(xué)家們在鹽藻和細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)BR 和HR后，相繼在真菌和其他微生物中也發(fā)現(xiàn)了多種視紫紅質(zhì)［6］。這些視紫紅質(zhì)統(tǒng)稱為微生物視紫紅質(zhì)。

2.3 通道蛋白視紫紅質(zhì)（ChRs）

2002 年，Nagel 等［11］又在萊茵衣藻中發(fā)現(xiàn)了第三類電導(dǎo)調(diào)節(jié)的微生物視紫紅質(zhì)——通道蛋白視紫紅質(zhì)（channelrhodopsins，ChRs）。它是一種光門控陽離子通道，可通過不同波長光的刺激來控制陽離子進(jìn)入細(xì)胞，改變膜內(nèi)外電位差，從而達(dá)到膜去極化的作用［12］。2002 年在萊茵衣藻中發(fā)現(xiàn)的通道視紫紅質(zhì)1（channelrhodopsin-1，ChR1）是第一個(gè)被鑒定的ChRs，其主要介導(dǎo)氫離子的傳遞［11］。但由于其導(dǎo)電性低，故并不適合作為光敏蛋白。次年，通道視紫紅質(zhì)2（channelrhodopsin-2，ChR2）的生物功能也逐步被探索出來［13］。經(jīng)過證明，ChR2 只需要簡單的光照就可以讓細(xì)胞產(chǎn)生去極化作用。近幾年來，研究人員不斷探索微生物視紫紅質(zhì)，在ChR1 或ChR2 的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上不斷改進(jìn)。2013 年，Govorunova等［14］發(fā)現(xiàn)了最大吸收波長在445 nm 處的PsChR。該視蛋白比ChR2 對鈉離子選擇性更強(qiáng)，對光更加敏感。ChRGR（ChR-green receiver）是在ChR1 的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)得到的嵌合體蛋白分子，具有最小的脫敏特性和靈敏的動(dòng)力學(xué)特征［15］，有望被應(yīng)用在光遺傳學(xué)研究中。

除以上兩種改良蛋白外，目前還發(fā)現(xiàn)了C1V1（ChR1/VChR1 Chimera）、ReaChR、CnChR1（Chrimson）、ChRFR（ChR-fast receivers）、ChIEF、ShChR（hronos）等ChRs 類視蛋白［16-20］，這些通道蛋白的出現(xiàn)使光遺傳學(xué)技術(shù)在科學(xué)探究上更進(jìn)了一步。ChRs 現(xiàn)已成為應(yīng)用最多、研究最廣的微生物視紫紅質(zhì)。

圖1 微生物視紫紅質(zhì)的功能Fig. 1 Function of bacteriorhodopsin

3 光遺傳學(xué)的臨床研究發(fā)展現(xiàn)狀

3.1 腦卒中

腦卒中是一種急性腦血管疾病，也是嚴(yán)重危害人類健康的神經(jīng)性疾病之一［21］。其發(fā)病機(jī)制是腦部血管突然破裂，或者因血管阻塞導(dǎo)致血液不能流入大腦，從而引起腦組織損傷。目前臨床上治療腦卒中的方法有藥物治療、血管內(nèi)治療、腦細(xì)胞移植、腦刺激法和經(jīng)顱光生物刺激療法等［22］。其中腦刺激法直接靶向調(diào)控致病區(qū)神經(jīng)元，可細(xì)分為經(jīng)顱直流電刺激、經(jīng)顱磁刺激、硬膜外刺激三種。傳統(tǒng)腦刺激法能激活或者抑制致病區(qū)的所有神經(jīng)元，因而我們無法準(zhǔn)確定位具體調(diào)控腦卒中發(fā)生與恢復(fù)的細(xì)胞。且使用該方法對患者身體會(huì)產(chǎn)生一定的副作用。治療時(shí)，腦刺激法敵我不分，一些正常的神經(jīng)元也會(huì)被攻擊，從而受到損傷，導(dǎo)致術(shù)后出現(xiàn)頭暈、精神亢奮等癥狀。經(jīng)顱光生物刺激療法的原理是使用低功率激光直接照射頭部，或者開顱后將激光運(yùn)輸?shù)绞軅X組織，通過光照活化細(xì)胞色素c 氧化酶（cytochrome c oxidase，CCO）后，CCO 發(fā)生一系列二次事件來調(diào)控細(xì)胞。它的作用原理與光遺傳學(xué)研究方法相似，但在精確調(diào)控細(xì)胞方面又顯示出不足，且目前尚不清楚用多大功率的光能透過某處大腦實(shí)質(zhì)產(chǎn)生生物效應(yīng)。已有的研究顯示，光遺傳學(xué)技術(shù)能夠通過刺激缺血周圍區(qū)域神經(jīng)元，如光生抑制紋狀體γ-氨基丁酸能神經(jīng)元（GABAergic neurons），以改善組織狀況［23］、精確調(diào)控靶細(xì)胞，并彌補(bǔ)光刺激法的不足。而在腦缺血小鼠模型中，通過使用光遺傳技術(shù)調(diào)控運(yùn)動(dòng)區(qū)的不同回路已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)［24］。目前，科學(xué)家們已探索出大腦中與腦卒中致病機(jī)制及恢復(fù)相關(guān)的一些靶向區(qū)域，如同側(cè)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)、不同的皮質(zhì)脊髓回路和神經(jīng)源性小生境腦室下區(qū)等，為將光遺傳學(xué)進(jìn)一步應(yīng)用于腦卒中的臨床治療提供了可能的研究方向。

3.2 帕金森病（PD）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是世界上第二大神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，多發(fā)生于老年人。該病主要表現(xiàn)特征為動(dòng)作緩慢、肌肉僵硬，以及肢體或者身體其他部位靜止性震顫，同時(shí)還伴隨有認(rèn)知功能障礙和自主神經(jīng)功能紊亂等問題［25］。PD 的主要致病機(jī)制是大腦黑質(zhì)密部多巴胺神經(jīng)元丟失，但目前并不清楚引起多巴胺神經(jīng)元丟失的原因［26］。現(xiàn)階段PD 患者主要依靠藥物治療，但始終達(dá)不到徹底根治的效果，還會(huì)產(chǎn)生藥物耐受等副作用。因此，我們需要尋求一種新的治療方法，能夠突破傳統(tǒng)治療方法的局限，針對病癥治標(biāo)治本。光遺傳學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)為治療PD 帶來了曙光。Kravitz 等［27］發(fā)現(xiàn)光刺激紋狀體直接通路中間投射神經(jīng)元能明顯改善小鼠的僵硬、運(yùn)動(dòng)緩慢的行為，說明基底神經(jīng)節(jié)回路能調(diào)節(jié)PD 的運(yùn)動(dòng)癥狀，直接通路中間投射神經(jīng)元與PD 運(yùn)動(dòng)癥狀的發(fā)生有關(guān)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)表明，紋狀體可作為臨床上治療PD 運(yùn)動(dòng)癥狀的靶點(diǎn)。

2010年，Bass等［28］在試驗(yàn)中利用光遺傳學(xué)技術(shù)控制多巴胺神經(jīng)元的離子通道，以此來精確控制多巴胺的釋放。通過此種方法治療PD，不僅避免了藥物帶來的運(yùn)動(dòng)障礙等副作用，而且不會(huì)損傷其他不相關(guān)的神經(jīng)元。PD 功能認(rèn)知障礙是一種非運(yùn)動(dòng)癥狀。早前有臨床數(shù)據(jù)表明，藍(lán)斑去甲腎上腺素能神經(jīng)元（locus coeruleus norepinephrine neuron，LC-NE）與之密切相關(guān)［29-30］。2012 年，Vazey 等［31］將光敏感蛋白植入LC-NE 中，并利用光刺激整合了光敏感蛋白的LC-NE ，結(jié)果表明其能夠調(diào)節(jié)對外觀環(huán)境的感知。因此，光遺傳學(xué)技術(shù)被認(rèn)為在治療PD的運(yùn)動(dòng)癥狀與非運(yùn)動(dòng)癥狀方面上均有較好的應(yīng)用前景。

3.3 癲癇

癲癇是大腦神經(jīng)元突發(fā)性同步異常放電導(dǎo)致短暫的大腦神經(jīng)功能障礙的一種慢性腦部疾病［32］。其發(fā)病主要原因是神經(jīng)元回路的興奮與抑制失調(diào)。發(fā)作時(shí)，異常興奮的神經(jīng)元處于動(dòng)態(tài)中，因此有針對性的精確控制神經(jīng)元活動(dòng)的時(shí)間顯得較為困難［33］。現(xiàn)階段癲癇的主要治療方法有藥物治療、手術(shù)和電刺激療法。臨床上常用的治療方式為藥物治療。這種治療方法能控制大部分癲癇患者的發(fā)病，但由于藥物是多靶點(diǎn)治療，在治療致病細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)損傷其他神經(jīng)元［34］。此外，還有少部分患者發(fā)展成為耐藥性癲癇，藥物對其作用效果不明顯。光遺傳學(xué)作為能精準(zhǔn)控制細(xì)胞的嶄新技術(shù)，為治療癲癇開辟了一條新通道。

目前，利用光遺傳學(xué)技術(shù)治療癲癇的原理主要是調(diào)節(jié)抑制性中間神經(jīng)元活性和興奮性錐體細(xì)胞［35］。NpHR（natromonas pharaonis halorhodopsin）是一種氯離子泵，屬于HR 類光敏感蛋白，能引起細(xì)胞產(chǎn)生超極化反應(yīng)。2009 年，Tonnesen 等［36］在體外建立海馬區(qū)癲癇模型，并且將NpHR 植入海馬錐體細(xì)胞和顆粒細(xì)胞內(nèi)，利用黃光照射，最后證明了光控NpHR 能縮短癲癇發(fā)作的時(shí)間。該試驗(yàn)為光遺傳學(xué)技術(shù)治療癲癇提供了依據(jù)。Sukhotinsky 等［37］在2013 年又通過體內(nèi)癲癇模型——活大鼠海馬區(qū)椎體神經(jīng)元植入eNpHR3.0，證實(shí)了光照能延緩癲癇持續(xù)狀態(tài)的潛伏期。試驗(yàn)結(jié)果顯示，光遺傳學(xué)治療在一定程度上可減輕癲癇癥狀。同年，Selvaraj 等［38］報(bào)道，使用開環(huán)光生控制能抑制癲癇樣活動(dòng)發(fā)作。他們使用ChR2 研究了脈沖和恒定光照對離子通道電導(dǎo)的影響，結(jié)果顯示，光生通道的固有特性確保了大腦皮層的電荷平衡，抑制細(xì)胞群是開環(huán)控制的目標(biāo)，從而使癲癇發(fā)作波被成功地抑制。從目前多個(gè)研究結(jié)果來看，光遺傳學(xué)治療癲癇的可行性在于其能精確控制靶細(xì)胞活性以及在時(shí)間上的高效把控，且使用光刺激調(diào)控細(xì)胞的反應(yīng)能在毫秒內(nèi)發(fā)生，無需等待其他介質(zhì)的傳遞。

4 總結(jié)與展望

通過本篇綜述，我們著重討論了光遺傳學(xué)技術(shù)治療腦卒、PD 和癲癇的研究進(jìn)展。從以上所述的研究現(xiàn)狀來看，光遺傳學(xué)在神經(jīng)內(nèi)科疾病中的應(yīng)用目前正處于探索階段，僅限于實(shí)驗(yàn)室的研究，暫時(shí)還不能直接應(yīng)用到疾病的診斷和治療中。不可否認(rèn)的是，光遺傳技術(shù)目前也存在許多尚未解決的問題。如有限的細(xì)胞特異啟動(dòng)子直接決定了病毒載體運(yùn)送的光敏基因調(diào)控的細(xì)胞種類，因此，如何將光敏基因通過病毒載體植入細(xì)胞并得到高表達(dá)性，還需要更多的研究去突破。同時(shí)，在臨床應(yīng)用上，使用的病毒載體對人體產(chǎn)生的細(xì)胞毒性和免疫應(yīng)答反應(yīng)的程度、病毒載體的長期轉(zhuǎn)染對大腦的影響、遞送載體的替代和改良，以及設(shè)計(jì)出能夠安全插入大腦的探針等，都還需要不斷研究、優(yōu)化。再者，光遺傳學(xué)作為近年來一個(gè)新興的跨越學(xué)科的研究技術(shù)，目前迫切需要掌握多門學(xué)科知識和技能的復(fù)合型研究人才對其進(jìn)一步開發(fā)利用，這一限制也是這個(gè)領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn)。

但相比其他治療神經(jīng)損傷的技術(shù)，這項(xiàng)新興技術(shù)最大的優(yōu)勢在于精準(zhǔn)調(diào)控特定細(xì)胞和精確把控時(shí)間這兩方面，打破了傳統(tǒng)治療神經(jīng)內(nèi)科疾病的種種局限性，如傳統(tǒng)藥物治療時(shí)間長、效果不明顯且副作用大，電刺激法波及神經(jīng)元范圍廣等缺點(diǎn)。同時(shí)，目前使用的傳統(tǒng)方法治療神經(jīng)內(nèi)科疾病不僅費(fèi)用昂貴，多數(shù)家庭難以承受，而且預(yù)后效果欠佳，只能改善而不能阻止病情的發(fā)展，病人也因此有了嚴(yán)重的心理負(fù)擔(dān)，從而影響患者的生命質(zhì)量。以光遺傳學(xué)技術(shù)作為新的突破口，這項(xiàng)近似無創(chuàng)治療的技術(shù)能降低開顱手術(shù)帶來的風(fēng)險(xiǎn)，且沒有副作用，從生理上和心理上都能極大地減輕患者的痛苦。選擇性的靶向治療也增大了治愈的可能性，甚至可能徹底根治疾病，提高患者的生命質(zhì)量。光遺傳學(xué)理論和技術(shù)體系的建立，不僅是科技創(chuàng)新的一大重要成果，更為治療疾病提供了一種全新且更為精準(zhǔn)的思路和方法。隨著越來越多的疾病發(fā)病機(jī)理被揭示，光遺傳學(xué)技術(shù)將會(huì)被應(yīng)用到更多的疾病中去，尤其是與神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域相關(guān)的疾病治療。目前已有大量研究表明［39-42］，光遺傳學(xué)技術(shù)在抑郁癥發(fā)病機(jī)制、心臟電生理、疼痛、睡眠焦慮、腫瘤、視網(wǎng)膜疾病、運(yùn)動(dòng)障礙、聽覺研究和成癮機(jī)制等研究領(lǐng)域有了新的突破，有望被應(yīng)用于治療這些疾病。光遺傳學(xué)不僅為人們打開了精準(zhǔn)控制神經(jīng)元的新視野，同時(shí)也在疾病病理和治療方面提供了全新的方法，以幫助我們對自身健康和疾病進(jìn)行更深層次的探索。