綿羊葡萄球菌的分離鑒定

李仕林，王雅雯，姜水兵，郭良帥，努爾麥麥提·麥麥提敏，王新新，焦海宏

（塔里木大學動物科學學院新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾843300）

葡萄球菌在自然界中分布極廣、種類繁多，分為非致病菌和致病菌。葡萄球菌可引起化膿性感染，是引起綿羊發病的病原菌之一。近年來，獸醫臨床上主要使用抗生素治療畜禽疾病，導致細菌耐藥性加重，中草藥具有不易產生耐藥性的特點。甘草具有補脾益氣、清熱解毒、止咳祛痰等多種功效[1]。甘草對葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌等細菌有明顯的抑制作用[2]?，F代藥學研究發現，甘草具有鎮咳祛痰、有抗癌、抗炎、抗氧化、抗過敏、治療艾滋病、防治肝損害、抗心律失常、皮質激素樣、抗病毒、免疫調節等多種藥理作用[3-4]。王曉利等[5]用甘草甜酸、甘草多糖、光甘草對小鼠巨噬細胞的毒性與免疫功能調節進行試驗研究，發現甘草甜酸、甘草多糖、光甘草均能增加巨噬細胞的吞噬能力。甘草黃酮類化合物可抑制腫瘤細胞轉移，誘導腫瘤細胞自噬和凋亡[5-6]對各種腫瘤細胞均有抑制作用。Yu等[7]從光果甘草黃酮類中提取出生松素，表現出強抗氧化能力及亞硝酸鹽清除能力。張敏[8]研究表明，甘草總黃酮可能是通過對突觸可塑性關鍵蛋白表達的調節而發揮抗抑郁作用的。研究中草藥藥理作用對開發新藥有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從新疆地區某規模化羊場無菌采集患病綿羊鼻拭子20份，4 ℃冰箱保存。

1.2 試驗試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂培養基、胰蛋白胨大豆肉湯培養基均購自北京奧博星生物技術有限責任公司；腦心浸液瓊脂培養基購自碧迪醫療器械（上海）有限公司；5%綿羊血平板（自制）；細菌基因DNA 提取試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司；細菌16S rDNA 的PCR 擴增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；麥氏比濁管購自常德比克曼生物科技有限公司。1%PBS、1%結晶紫、3%過氧化氫、5%綿羊血清、兔血漿等試劑。新霉素（30 μL/片）、氯霉素（30 μL/片）、諾氟沙 星（10 μL/片）、環 丙 沙 星（5 μL/片）、羅紅 霉 素（15 μL/片）、頭孢曲松（30 μL/片）、頭孢哌酮（75 μL/片）均購自杭州微生物試劑有限公司。甘草購自新疆阿拉爾市郭森中藥房。

1.3 試驗儀器

DHP-9080 型恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）、101-1ES電熱鼓風干燥箱（北京市永光明醫療儀器有限公司）、ZWY-240 臺式恒溫搖床（上海智城儀器有限公司）、BL-75A 型立式壓力蒸汽滅菌氣筒（上海東亞壓力容器制造有限公司）、H-1650-W臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 葡萄球菌分離培養

制備TSB 培養基、TSA 培養基，將樣品接種于TSA 培養基，37 ℃恒溫培養24 h，革蘭氏染色鏡檢，將疑似菌接種于TSB培養基搖床培養6～8 h，進一步接種于5%綿羊鮮血平板，37 ℃恒溫培養箱24 h培養，觀察菌落特征。

1.4.2 革蘭氏染色及鏡檢

挑取單個疑似葡萄球菌菌落或溶血菌落進行革蘭氏染色鏡檢。

1.4.3 生化試驗

試驗采用過氧化氫酶、兔血漿凝固酶試驗。

1.4.4 16S rRNA基因擴增

根據細菌DNA 提取試劑盒說明書，進行菌體DNA 提取，進行16S rRNA基因擴增，1492R：TACGGCTACCTTG TTACGACTT，27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，目的片段大小1500 bp 左右。反應條件：94 ℃預變性5min，(94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30 個循環)，72 ℃延伸10 min。將PCR 產物送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序，測序結果在NCBI 數據庫進行Blast對照，確定菌種。

1.4.5 藥敏試驗

取活化菌液適量，用生理鹽水稀釋至1.5×108CFU/mL 均勻涂布于BHI 固體培養基，將各種抗菌藥物片貼于培養基表面，37 ℃培養24 h觀察結果，測量抑菌圈大小。依據參考文獻[8]確定判定標準，抑菌圈直徑小于10 mm為耐藥；直徑在10～15 mm為中度敏感；直徑大于15 mm以上為高度敏感。

1.4.6 甘草抑菌試驗

1.4.6.1 水煮法制備藥液

將甘草稱重加入8～10 倍純凈水浸泡30～60 min，進行煎煮，第1 次煎煮30 min，第2 次加入5 倍純凈水煎煮15 min，過濾；合并2次濾液，藥液終濃度為1 g/mL，離心取上清121 ℃高壓滅菌，4 ℃保存。

1.4.6.2 甘草水煎液對葡萄球菌最低抑菌濃度（MIC）

采用肉湯微量稀釋法進行測定。向TSB 液體培養基（已滅菌）中加入1%葡萄糖、0.002%酚紅。取細菌瓶編號1～13，分別向1～10 瓶加入1 mLTSB 液體培養基；1 號瓶加入1 mL 甘草水煎液（含藥量1 g/mL）二倍稀釋至10 號瓶；11號瓶中加入2 mL TSB液體培養基做對照。將菌液用生理鹽水稀釋成1.5×106CFU/mL 菌液（麥氏比濁進行比對），取1 mL稀釋的菌液與9 mL TSB液體培養基混合，稀釋成1.5×105CFU/mL 菌液向1～10 號細菌瓶中分別加入1 mL（1.5×105CFU/mL）菌 液；12 號 瓶 中 加 入2 mL（1.5×105CFU/mL）菌液；13號瓶中加入2 mL甘草水煎液（含藥量1 g/mL），37 ℃恒溫培養箱過夜培養（重復3 次）。結果判定：以能夠抑制試驗菌生長藥物最高稀釋度為最低抑菌濃度（MIC）。

2 結果與分析

2.1 菌株分離培養結果（見圖1）

由圖1 可知，疑似菌菌落在血平板上呈白色、圓形菌落，周圍有溶血環。

圖1 菌株在血平板上的特征Fig.1 The characteristics of the strain on the blood plate

2.2 菌株革蘭氏染色鏡檢結果（見圖2）

由圖2 可知，革蘭氏染色鏡檢呈陽性球菌，成葡萄串狀樣。

圖2 菌株革蘭氏染色鏡檢結果Fig.2 Strain Gram staining microscopic examination results

2.3 菌株生化試驗結果（見圖3、圖4）

圖3 過氧化氫酶試驗結果Fig.3 Results of catalase test

由圖3、圖4 可知，過氧化氫酶試驗有氣泡產生，呈陽性；血漿凝固酶試驗出現凝集現象，呈陽性。

2.4 16S rRNA基因擴增結果（見圖5）

由圖5可知，經初步分離鑒定，將純化菌株的PCR產物送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序，測序結果在NCBI數據庫進行BLAST對照，共鑒定出10株葡萄球菌，分別編號為nj1、nj2、nj3、nj4、nj5、nj6、nj7、nj8、nj9、nj10。

圖4 血漿凝固酶試驗結果Fig.4 Result of plasma coagulase test

圖5 16S rRNA電泳圖譜Fig.516S rRNA electrophoretogram

2.5 藥敏試驗結果（見表1）

由表1可知，葡萄球菌對卡那霉素、諾氟沙星、環丙沙星、頭孢哌酮、頭孢曲松高度敏感；對新霉素中度敏感；對羅紅霉素耐藥。

表1 各菌株藥敏試驗的抑菌圈大小Tab.1 The size of the inhibition zone of each strain drug sensitivity test 單位：mm

2.6 甘草對葡萄球菌的抑菌作用

經試驗測得甘草液對葡萄球菌的平均最小抑菌濃度（MIC）為0.5 g/mL，表明甘草對葡萄球菌具有抗菌活性。

3 討論

本次試驗從病料中分離出葡萄球菌，與段龍川等[10]及裴志花等[11]從羊病料中分離的病原菌相同。藥敏試驗結果表明，葡萄球菌對頭孢曲松敏感。獸醫臨床治療中發現，由葡萄球引起的動物疾病在抗生素治療過程中耐藥水平高、耐藥譜廣，給養殖業造成嚴重的損失。建議在養殖生產過程中明確病原情況，進行藥敏試驗，篩選出敏感抗生素，再進行預防治療，從而減少抗生素濫用，減少獸藥殘留。

本試驗測得甘草水煎液對葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.5 g/mL，對葡萄球菌的生長具有抑制作用。甘草酸是甘草中的主要活性物質之一，對球菌和桿菌均有明顯的抑制作用[12]。因此推測本試驗葡萄球菌的抑制作用可能是甘草酸所表現出的抑菌活性。因此，獸醫臨床上可用甘草對由葡萄球菌引起的動物相關疾病進行預防治療。

4 結論

本試驗從病料中分離出10葡萄球菌。藥敏試驗表明，葡萄球菌對卡那霉素、諾氟沙星、環丙沙星、頭孢哌酮、頭孢曲松敏感；對新霉素中度敏感；對羅紅霉素耐藥。試驗測得甘草水煎液對葡萄球菌的平均最小抑菌濃度為0.5 g/mL，對葡萄球菌的生長具有抑制作用。