四黃止痢復方中藥納米乳的制備及其質量評價

鄭曉婷，蔣 紅，王宏軍

（錦州醫科大學，遼寧錦州121001）

四黃止痢復方中藥組方中以黃連、黃芩為主藥，黃連瀉心火兼瀉中焦火，黃芩瀉肺火于上焦；輔以大黃泄熱通腸，清除胃腸濕熱積滯，且板藍根清熱解毒，并助主藥解熱，為輔藥；黃檗瀉腎火于下焦為佐藥；甘草清熱解毒，諸藥合用具有清熱解毒、澀腸止瀉之功效[1]。主治大腸桿菌類疾病，同時還可有效預防和治療鴨疫里莫氏桿菌、仔豬黃白痢、流行性、細菌性、濕熱性腹瀉的防治，還可用于種蛋消毒[2-4]。納米藥物是納米技術與藥學相結合后研發的一種新劑型。納米制劑與其他劑型比較來說其粒徑更小、比表面積更大、表面反應活性更高、活性中心更多。納米制劑可以有效提高中藥的溶解度，提升生物利用度，提升藥物療效，起到緩釋控釋作用和靶向作用。納米制劑可以在保證藥效的同時降低毒性、副作用以及減少用藥量[5]。文章旨在研究制備四黃止痢復方中藥納米乳，并對其質量進行評價。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

KQ3200DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、FA2004N型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）、78-1 磁力加熱攪拌器（江蘇省金壇市宏華儀器廠）、HC-1000V 型粉碎機（永康市天琪盛世工貿有限公司）、0.22 μm 微孔過濾膜（錦州市眾源實驗經銷處）、上海雷磁PHS-3C 臺式酸度計（上海雷磁儀器有限公司）、恒溫培養箱（北京金北德工公司）。

1.2 試驗材料

大黃提取物（西安瑞林生物科技有限公司）、黃芩提取物（西安瑞盈生物科技有限公司）、黃連提取物（西安瑞盈生物科技有限公司）、黃檗提取物（西安瑞盈生物科技有限公司）、板藍根提取物（西安瑞盈生物科技有限公司）、甘草提取物（西安瑞盈生物科技有限公司）、IPM（上海麥克林生化科技有限公司）、油酸乙酯（濟南匯錦川商貿有限公司）、聚氧乙烯40 蓖麻油（山東信恒化工有限公司）、聚乙二醇（天津市東麗區天大化學試劑廠）、聚山梨醇酯（天津福晨化學試劑有限公司）、1，2 丙二醇（天津市標準科技有限公司）、丙三醇（天津福晨化學試劑有限公司）、吐溫80（天津福晨化學試劑有限公司）、蘇丹紅Ⅲ（上海瀚思化工有限公司）、亞甲藍（上海瀚思化工有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 繪制偽三元相圖

按油相、水相、表面活性劑與助表面活性劑混合相在臨界點是其各自的質量百分數，用等邊三角形的三條邊分別表示水相、油相以及表面活性劑與助表面活性劑混合相[6]，用Origin 8.5 軟件繪制該納米乳的偽三元相圖，篩選出最優處方。

1.3.2 處方的選擇

1.3.2.1 油相的選擇

納米乳中使用的油應與表面活性劑保持互相作用，而且易于成膜[7]。油相鏈越短，油相越易滲透到膜中，碳氫鏈越長的油相，則會提高藥物的溶解度。本試驗待選油相有肉豆蔻酸異丙酯（IPM）、大豆油、油酸乙酯、橄欖油。

1.3.2.2 表面活性劑的選擇

表面活性劑可根據親水親油平衡（HLB）值進行篩選，HLB值在3～8的乳化劑可制備成W/O型納米乳，HLB值在8～16 的乳化劑可制備O/W 型納米乳[8]。本試驗待選表面活性劑和HLB 值均大于7，分別為吐溫80、聚氧乙烯蓖麻油（RH40）、聚山梨醇酯、泊洛沙姆（HLB 值高于20 的通常作為助表面活性劑來調節總體HLB值，以求達到納米乳制備所需的條件）。

1.3.2.3 助表面活性劑的選擇

助表面活性劑在納米乳的形成過程中可以協調降低水相、油相的表面張力，增加表面活性劑的溶解度[9]，一般選擇中鏈、短鏈醇。本試驗以聚乙二醇、1，2 丙二醇、無水乙醇、丙三醇作為助表面活性劑。

1.3.2.4 表面活性劑和助表面活性劑質量比（Km）的確定

將表面活性劑吐溫80、助表面活性劑丙三醇、油相IPM混合成乳，分別選擇Km值為0.5、1、2、3制作偽三元相圖，觀察圖中成乳區域面積的大小、乳化顆粒在乳液中的性質、乳化程度及體系穩定性，來確定最佳Km值。

1.3.2.5 含藥納米乳的制備

精確稱量IPM、吐溫80、丙三醇、水于燒杯中，室溫下借助磁力攪拌機攪拌至澄清即得空白納米乳。分多次少量將四黃止痢提取物（ECCS）加入制備好的空白納米乳中，觀察ECCS的用量。

1.3.3 質量評價

1.3.3.1 納米乳的評價標準

肉眼觀察外觀形態，平行光照射，乳滴粒徑檢測。

1.3.3.2 鑒別試驗取兩份2～3 mL 四黃止痢納米乳（ECCS-NE）分別加入2 支試管中，再分別向2 支試管中加入蘇丹紅Ⅲ和甲基藍溶液1～2滴，觀察到紅、藍兩溶液的擴散速度快，若蘇丹紅Ⅲ溶液擴散比甲基藍擴散快，則ECCS-NE 為W/O 型。若甲基藍溶液擴散的比蘇丹紅Ⅲ溶液擴散快，則ECCSNE為O/W型[10]。

1.3.3.3 粒徑分布及Zeta電位

送至北京中科百測負染電鏡觀察納米乳形態。

1.3.3.4 pH值

取l0 mL ECCS-NE，置于燒杯中，用pHS-3C 型精密酸度計測定pH值。

1.3.4 穩定性

1.3.4.1 光照試驗

根據《中國藥典》2015版，將3組不同批次制備的納米乳置于4000～5000 lux 強度下進行光照，分別于0、5、10 d觀察納米乳外觀狀態、pH值。

1.3.4.2 溫度試驗

根據《中國藥典》2015 版，將3 組不同批次制備的9 管納米乳于25、50、70 ℃，相同濕度下放置，分別于0、5、10 d時觀察納米乳狀態。

1.3.4.3 濕度試驗

將3 組不同批次制備的6 管納米乳于70%、90%濕度于密閉容器室溫放置，分別于0、5、10 d 時觀察納米乳狀態。

1.3.4.4 離心試驗

高速離心可有效評價納米乳體系的穩定性，取5 mL ECCS-NE 于離心管中，在室溫下10000 r/min 離心25 min，觀察樣品狀態。

1.3.4.5 靜置試驗

取一定量的樣品于密閉容器25 ℃放置0、10、30、60 d。

1.3.5 包封率和載藥量

量取制備的ECCS-NE10 mL，加甲醇在25 mL容量瓶中定容，超聲10 min，吸取1 mL加甲醇于5 mL容量瓶中定容。0.22 μm微孔過濾膜濾過待檢，所得藥物含量W1，3次平行試驗。再次量取制備的ECCS-NE 5 mL，加37 ℃的純水在10 mL 容量瓶中定容，搖勻，量取3 mL，置離心管10000 r/min離心20 min，精密量取上清液1 mL，加入適量甲醇混勻，超聲助溶10 min，待其冷卻到室溫。0.22 μm微孔過濾膜濾過待檢，所得藥物含量W2，3 次平行試驗。按已有公式得出載藥量及包封率[11]。

2 結果與分析

2.1 處方的選擇

2.1.1 油相的選擇

根據2015版獸藥典標準，稱取10 mL四黃止痢復方中藥溶液置于室溫下滴加在10 mL備選油相中，邊滴加邊振蕩至飽和，靜止5 min 后振蕩30 s，觀察30 min 內溶解情況，平行測定3次結果顯示，ECCS溶液在IPM中溶解度最大。因此，選擇IPM為油相。

2.1.2 表面活性劑的選擇

聚山梨醇酯、聚氧乙烯40蓖麻油所形成的納米乳體系放置一段時間后體系渾濁。偽三元相圖法繪制吐溫80、泊洛沙姆體系的偽三元相圖。結果表明，吐溫80作為表面活性劑時成乳區域更大，因此確定吐溫80為表面活性劑。

2.1.3 助表面活性劑的選擇

聚乙二醇、1，2 丙二醇、無水乙醇、丙三醇與表面活性劑Tween 80 混合后；按照不同的質量比與油相混合，滴加水相，均可形成納米乳體系。但無水乙醇放置后揮發體積減小、1，2丙二醇出現渾濁。偽三元相圖法繪制聚乙二醇、丙三醇體系的偽三元相圖，確定以丙三醇為助表面活性劑。

2.1.4 Km值的確定（見圖1）

圖1 不同Km值所繪制的偽三元相圖Fig.1 Pseudo ternary phase diagram drawn by different Km values

Km 是決定納米乳形成的重要條件[12]，分別以Km=0.5、Km=1、Km=2、Km=3，油相為IPM、表面活性劑為吐溫80、助表面活性劑為丙三醇，以“1.3.1”項方法繪制偽三元相圖。由圖1 可知，納米乳成乳面積為Km=2＞Km=0.5＞Km=1＞Km=3，因此篩選出Km值為2。

2.1.5 處方篩選結果

以四黃止痢復方中藥為原料藥，IPM 為油相，吐溫80為表面活性劑，丙三醇為助表面活性劑制成復方納米乳，乳液黃色澄清透明、無沉淀、無分層、性質穩定。油相與表面活性劑比為1∶4，Km 值為2∶1，所制備的納米乳粒子的粒徑大小等各方面均最穩定。

2.2 含藥納米乳的制備

精確量取吐溫804 mL、丙三醇2 mL，置于50 mL燒杯中，在磁力攪拌器的作用下，37 ℃恒溫攪拌，緩慢滴加1 mL IPM，繼續在37 ℃的恒溫磁力攪拌器下進行混勻，加入20 mL蒸餾水，在上述條件下繼續混勻，加入ECCS攪拌至完全溶解，得澄清透明的四黃止痢復方中藥納米乳制劑。

2.3 四黃止痢復方中藥納米乳的評價

2.3.1 外觀形態觀察及乳液類型

外觀呈透明或者半透明狀態；且有乳光；10000 r/min離心25 min，乳液穩定無分層或絮凝現象；平行光照射后出現丁達爾現象，可觀察到亞甲基藍的擴散速度較蘇丹紅Ⅲ擴散快，判斷ECCS-NE為O/W型。

2.3.2 粒徑分布及Zeta電位（見圖2）

圖2 納米乳透射電子顯微鏡照片Fig.2 Transmission electron microscope photo of nanoemulsion

由圖2 可知，納米乳顆粒是分布均勻的圓球形且大小基本一致，ECCS-NE 的粒徑為（45.06±2.47）nm，ECCSNE的Zeta電位為-6.11 mV。

2.3.3 pH值檢測結果（見表1）

由表1可知，pH值的平均值為6.94，該制劑偏酸性。

表1 pH值檢測結果Tab.1 pH value test results

2.4 穩定性

ECCS-NE 分別采用光照射試驗、溫度試驗、濕度試驗、離心試驗、常溫靜置，試驗仍黃色澄清液體、無沉淀、無水油分層。

2.5 包封率和載藥量（見表2）

表2 包封率及載藥量檢測結果Tab.4 Test results of encapsulation efficiency and drug loading 單位：%

由表2 可知，該制劑的包封率為0.727，載藥量為84.8%。

3 討論

藥物的首過效應使動物口服藥物時效力降低，患禽用藥采取混水混飼方式時，導致藥物攝入量不均。因此，本試驗將四黃止痢復方中藥制成納米乳劑，借助納米劑的控釋、緩釋可提高藥物在體內停留時間，提高生物利用度。

油相、表面活性劑、助表面活性劑均應選擇對本試驗所用藥物溶解度大、無毒、無刺激，因而本試驗選用IPM、丙三醇、吐溫80、蒸餾水為成乳系統。備選油相中IPM 對四黃止痢復方中藥溶解度最大；選取吐溫80作為表面活性劑時成乳區最大；助表面活性劑常選用醇類來協助調解HLB 值和增加藥物溶解度，使其形成更穩定的納米粒子，因此選用丙三醇作為助表面活性劑。但是，醇類是揮發性的[13]。因此，必須將其密封存放，否則會引起藥物沉淀并影響納米乳劑的質量。

4 結論

通過繪制偽三元相圖的方法來確定四黃止痢復方中藥納米乳的最適制備工藝，并對其進行質檢，且穩定性良好。