聚合物納米材料在疫苗佐劑領域的應用進展

畢毓彤，周萌萌，李承禹，陳孝起，李彥濤，肖繼君*

（1. 河北科技大學材料科學與工程學院航空輕質復合材料與加工技術河北省工程試驗室河北省材料近凈成形技術重點試驗室河北省柔性功能材料重點試驗室，河北石家莊050018；2. 河北省科學院能源研究所，河北石家莊050081；3. 河北工業大學材料科學與工程學院，天津300130）

納米材料具有良好的生物相容性、黏膜吸收性、生物降解性、易加工等優點。因此，納米技術和納米材料科學的發展及應用在近年來得到各行各業的廣泛關注，尤其是在生物醫藥領域的研究進展。納米材料表面可控，通常通過包埋、吸附和化學鍵合等方式將藥物與粒子緊密結合，并傳輸到動物機體發揮作用[1-3]，能促進功能分子進入細胞，保護DNA 和蛋白質不被降解[4]。因此，納米材料在疫苗和藥物方面的研究越來越多[5]。目前，隨著對納米粒子的應用研究，聚合物納米材料因其優異的生物相容性和低黏膜粘附毒性[6]、結構穩定和高度藥物釋放可控性可提高藥物的穩定性和利用率，并且因其在機體的儲存作用、靶向作用、調控作用且易于表面修飾，具有穩定性好、安全性好等特點，在生物疫苗佐劑領域的應用越來越廣泛[7-8]。

文章從聚合物納米材料的種類、作用機理及研究應用現狀等方面總結聚合物納米顆粒佐劑、聚合物納米膠束和聚合物納米乳液在生物疫苗佐劑領域的應用與研究進展。

1 聚合物納米顆粒佐劑

聚合物顆粒最先在1976年由Kreuter 等[9]報道出其佐劑特性。聚合物納米顆粒不僅可以保護抗原免受酶解，且具有抗原儲存效應、APC 靶向性、免疫調控等作用，還具有易于表面修飾、穩定性好和安全性高的優點[10]。基于聚合物納米顆粒的獨特優勢，已成為近年來疫苗佐劑的熱門研究方向之一。

1.1 聚乳酸（PLA）類納米顆粒佐劑

隨著聚合物納米材料在生物領域的深入研究，生物相容性優良的聚乳酸材料得到眾多科研學者的關注與探究。自1995年，美國FDA（Food and Drug Administration）批準聚乳酸及其衍生物可以作為藥用輔料進行臨床應用[11]，聚乳酸納米材料在藥物釋放領域及生物免疫學領域的應用越來越廣泛[12-14]。

Tukhvatulin 等[15]制備的PLGA 納米顆粒，配合抗原使用，在小鼠試驗中表現出體液免疫和細胞免疫均得到增強；與使用非聚合物納米粒子的佐劑相比，抗原的保護效力提高10 倍左右。2009年，Jain 等[16]發現，PEG-PLAPEG 嵌段共聚物包埋乙肝表面抗原疫苗顆粒可以增強黏膜攝取，引起有效的免疫應答，試驗證明合成的納米粒子可作為口服免疫載體發揮作用。Thomas 等[17-18]采用雙相乳液溶劑蒸發法制備帶正電荷的聚乳酸-羥基乙酸共聚物包埋重組乙肝表面抗原（PLGA-HBsAg）顆粒，經肺部給藥后結果表明，帶有正電荷的顆粒可產生全身體液和黏膜免疫反應，且相比未用正電荷修飾的顆粒更有效。徐婧[19]制備帶正電荷的粒徑分別為100 nm、300 nm、1 μm的聚乳酸納米顆粒，并將OVA 吸附在聚乳酸顆粒表面，通過肌肉注射的方式對小鼠進行免疫，經過小鼠抗原特異性表達和脾細胞體外培養試驗。結果表明，合成的聚合物納米顆粒具有明顯的佐劑效果，隨著粒徑的減小聚乳酸顆粒佐劑效果更明顯，可以得出結論帶正電荷的聚乳酸顆粒是一種非常具有潛力的佐劑。張威風[20]采用微孔膜乳化技術制備粒徑均一的微球，與OVA 和流感裂解疫苗分別制備成亞單位疫苗，并研究粒徑、表面電荷、共用免疫增強劑和抗原裝載方式對微球佐劑效果的影響及作用機制，為聚乳酸納米顆粒在疫苗佐劑領域的應用發展提供參考。

此外，其他聚合物納米顆粒在疫苗佐劑的應用也有研究，例如聚谷氨酸納米顆粒[21-22]、聚賴氨酸納米顆粒、聚己內酯納米顆粒[23]等多種聚合物納米粒子作為疫苗載體或佐劑活性已有相關報道。

1.2 殼聚糖類納米顆粒佐劑

殼聚糖是一種天然多糖類陽離子高分子材料，具有生物相容性良好、生物降解性好和低毒性等優點，在藥物領域殼聚糖同樣得到廣泛研究與應用[24-25]。殼聚糖在機體內可以提高巨噬細胞和多形核細胞的聚集和活化。因此，Gordon等[26]和Reed等[27]研究發現，殼聚糖納米顆粒作為免疫佐劑應用時可明顯增強局部反應和系統的抗體反應。殼聚糖納米顆粒作為佐劑具有黏膜吸附性[27]、免疫刺激活性[28]、促滲作用[29]、緩釋和控制作用[25]以及特異靶向性[30]，其作用機理主要是抗原儲存作用[31]、靶向作用[32]、免疫調節作用[33]和抗原提呈作用[34]。基于殼聚糖及其衍生物納米顆粒的特性，在疫苗佐劑領域的研究與應用值得深入探討[35-36]。

董浩蘇等[37]采用殼聚糖納米粒子為魚類疫苗佐劑，研究該佐劑的免疫增強作用，發現該佐劑負載蛋白ETAE-1227 在斑馬魚進行免疫測試后，免疫性能與油佐劑相當，在未來可作為新型佐劑進行進一步研究。殼聚糖作為疫苗佐劑是安全有效的，且是一種有潛力的可應用于流感疫苗的引導黏膜免疫的佐劑[38-40]。Svindland等[41]研究發現，含殼聚糖佐劑的H5N1流感疫苗經小鼠鼻腔免疫可以明顯誘導流感病毒特異性抗體分泌細胞，能刺激機體在局部和全身產生高濃度抗體。該佐劑是一種具有潛力的流感疫苗佐劑，可進行下一步的臨床研究試驗。Alginate 等[42]采用海藻酸鈉包被殼聚糖納米顆粒作為甲型肝炎抗原的載體，對小鼠進行免疫應答試驗，通過提高血清轉化率，甲型肝炎抗體水平和脾細胞增殖可知該佐劑可以明顯提高免疫原性，刺激機體產生體液免疫和細胞免疫應答，具有平衡Th1/Th2 免疫響應的作用。

此外，殼聚糖納米顆粒也可以應用于熱裂谷熱病毒滅活抗原的載體，經免疫后，動物機體的中和抗體效價和免疫球蛋白G（IgG）效價得到顯著提高，白細胞介素-2（IL-2）和干擾素（IFN-r）表達相應增加，促進Th1 型免疫應答[43]。眾多研究學者聚焦于其他天然有機高分子聚多糖聚合物，如海藻酸鹽[44-45]是來自藻類細胞壁的陰離子多糖聚合物，海藻酸鹽對單核細胞、巨噬細胞具有顯著的活性激發作用和佐劑作用。研究報道，海藻酸鹽以共價鍵、納米凝膠和微粒的形式在亞單位疫苗進行應用。透明質酸是一種線性黏多糖，由D-葡萄糖醛酸和葡萄糖醛酸的雙糖重復單元組成，通過離子絡合作用與脂質體形成復合物，可負載蛋白等，通過刺激機體產生黏膜免疫反應[46]。

1.3 聚丙烯酸（PAA）類納米凝膠顆粒佐劑

聚丙烯酸材料具有安全、無毒、生物相容性好等優點，因此在生物醫用材料得到廣泛的應用。并且該材料與滅活病毒抗原經物理混合后進行機體免疫可誘導機體產生免疫應答[47-51]。

聚丙烯酸類納微粒凝膠可促使抗原在注射位點形成儲存庫產生持續釋放抗原效應，并刺激機體產生短的炎癥反應從而誘導機體固有免疫系統發揮作用，抗原和蛋白在聚丙烯酸佐劑表面有很強的吸附力且安全性好[52-53]。基于以上原因，聚丙烯酸類材料及其衍生物在免疫佐劑領域具有廣闊的應用前景。

聚丙烯酸水凝膠是一種高分子性能的特異性水溶有機高分子，水凝膠載體可以控制外界條件在一定的速率下釋放藥物[54]。Yoshida 等[55]制備具有pH 值響應性聚合物載體聚（甲基丙烯酸乙二醇）水凝膠，采用雞卵清蛋白（OVA）和霍亂毒素（CT）為抗原模型，通過體外摻入和釋放試驗顯示，該載體可以增加血漿的抗體IgG 水平，是一種有前途的口服疫苗載體。揭少衛等[56]制備具有pH 值敏感性殼聚糖/聚丙烯酸水凝膠磁微球，并研究該水凝膠磁微球對蛋白物質的吸附和釋放。因此，該聚合物水凝膠在疫苗佐劑的領域具有很高的潛在應用價值。

2 聚合物納米膠束佐劑

聚合物納米膠束是將具有親水和疏水基團的兩親嵌段共聚物在水中的自組裝形成，具有核-殼結構的納米膠束，由共聚物形成的納米膠束有載藥量高、載藥范圍廣、穩定性好、體內滯留時間長等特點，使用聚合物納米膠束可提高藥物的穩定性和生物利用度等[57-58]。近年來，聚合物納米膠束在疫苗和醫藥領域得到研究者的廣泛關注[59]。

Li 等[60]研究1 種兩親性嵌段膠束，可將負載的抗原（OVA）和免疫刺激佐劑（CL264）遞送至樹突狀細胞，在一定程度上促進樹突狀細胞的攝取、細胞因子的產生和抗原向T 細胞的交叉呈遞，促使動物機體產生強烈的細胞免疫。進一步的小鼠試驗證明，該膠束的遞送系統進行免疫，明顯阻止小鼠的腫瘤生長。羅資超等[61]制備一種由聚賴氨酸和聚亮氨酸合成的納米膠束，通過負載OVA 研究其免疫機理，經過小鼠試驗可知該聚多肽納米膠束是一種優良的疫苗載體，除可提高樹突狀細胞對抗原的攝取，還可以增強體液免疫。師帥等[62]采用聚乙二醇-聚己內酯合成骨架，通過與乙烯亞胺結合形成陽離子納米膠束，通過正負電荷的物理吸引完成對蛋白類抗原的表面吸附，采用簡單的電荷吸附完成抗原的裝載與吸附，增強機體對抗原的免疫應答；該納米佐劑具有低毒性、優秀的生物相容性、較好的免疫性以及優越穩定性。Song等[63]通過對聚（γ-谷氨酸）納米膠束中的多價羧基進行胺化，膠束的尺寸變小，通過模擬病原體進入淋巴結的引流試驗，研究表明，該膠束可激發淋巴結中炎癥小體和固有免疫系統。2020年，史林啟等[64]公開1 種可控捕獲、釋放抗原的納米復合膠束癌癥疫苗的制備方法，該疫苗的機制建立在PCL-b-PEG/PCL-b-PAE 復合膠束，依靠pH 值響應鏈段PAE 在不同pH 值條件進行疏水微區捕獲抗原和釋放抗原，該膠束合成方法簡單，在癌癥疫苗領域具有廣泛的研究及應用前景。

3 聚合物納米乳液佐劑

油乳佐劑屬于一種貯存型佐劑[65]，以礦物油加小分子乳化劑（如span-85 或Tween-80）及穩定劑（硬脂酸鋁）為連續油相，再與適當的抗原水溶液（分散相）混合乳化成油乳型佐劑。油乳佐劑在獸用生物制品中應用較多。油乳佐劑通常分為3種類型：水包油型、油包水型、水包油包水型佐劑[66]。因油乳佐劑含有礦物油，注射后往往引起動物機體組織炎癥、動物發熱等副反應。因此，采用聚合物與乳化劑和少量的油制備的聚合物納米乳液，可以有效避免炎癥，減少副反應的發生，且具有較好的免疫性能。

潘京學等[67]發明1 種動物疫苗的聚合物佐劑及其應用，將聚合物與乳化劑和助劑以一定的條件下制備成聚合物組合佐劑，抗原以儲存的形式在聚合物形成的囊泡中被包裹，也可以被聚合物均勻吸收，分布在聚合物內，該佐劑可輔助禽畜類疫苗發揮作用。史記華等[68]公布1 種聚丙烯酸類聚合物用于動物疫苗佐劑的研制方法，采用乳化劑合成的聚丙烯酸類聚合物佐劑，該佐劑誘導了強烈的免疫反應，并實現快速免疫保護和長期持續免疫保護，同時具有較好的生物相容性和生物可降解性。

4 結論

疫苗是防控傳染性疾病發生的重要措施之一，因此生產和使用安全有效的疫苗尤為關鍵。在疫苗的生產制備中，佐劑的添加尤為重要，佐劑的使用可以增強疫苗的免疫原性、減少抗原用量、提高安全性和穩定性等。聚合物納米材料與抗原結合后經免疫可在機體產生儲存庫效應，且抗原提呈細胞對聚合物納米粒子吞噬作用可激發固有免疫系統并刺激產生特異性免疫反應。聚合物納米佐劑因其具有良好的誘導體液免疫和細胞免疫的能力，成為最有潛力的疫苗佐劑之一。

聚合物納米材料的潛在佐劑作用受許多因素的影響，如免疫機體之間的種類差異、免疫系統的差異和納米粒子對機體的毒理性能都將影響聚合物納米材料是否依然保持佐劑活性；聚合物納米佐劑的形貌、表面化學性質、載體對抗原的釋放平衡等對也會對機體免疫性能產生影響；聚合物納米材料在制備過程中有機溶劑的含量對機體產生毒性等問題。因此，在未來的研究中將深入研究聚合物納米材料與機體免疫的作用機理；聚合物納米材料包被抗原的儲存與釋放穩定性及其對免疫機體的毒理作用等問題。隨著未來對聚合物納米佐劑材料作為佐劑及其作用機理的深入研究，必將制備出安全、穩定、高效的聚合物納米佐劑，聚合物納米材料作為新型生物疫苗免疫佐劑必將在傳染性疾病的預防中發揮重要作用。