菊苣多糖對小鼠藥物性肝損傷保護作用的篩選

王曉杰，吾買爾江·牙合甫，*，阿麗米熱·買買提，韓俊成，楊 莉，夏利寧，賽福丁·阿不拉，卡哈爾·司馬義

（1. 新疆農業大學動物醫學學院，新疆烏魯木齊830052；2. 哈密市伊州區花園鄉衛生院，新疆哈密839000）

菊苣（Cichorium intybusL.）屬于菊科菊苣族菊苣屬的多年生植物。菊苣中的化學成分主要含三萜、倍半萜、香豆素、花色素類等有效活性物質[1]。菊苣可入藥，具有清熱解毒、消炎利尿、清肝利膽等療效[2]。菊苣主治肝炎、肝衰竭、肝硬化、腎炎、腸炎等疾病[3]。多糖是一種大分子生物活性物質，菊苣多糖具有抗疲勞、抗氧化、降血脂、降血糖、抗癌、抗腫瘤等作用。多糖作為菊苣的有效成分之一，其多糖含量也頗高[4-6]。菊苣多糖保肝作用方面的研究已具備眾多數據支持，但沒有發揮菊苣多糖的最大藥用價值，導致資源的潛在浪費[7]。

對乙酰氨基酚（Acetaminophen，APAP）是一種廣泛使用解熱鎮痛藥物。臨床上普遍用于人、動物機體發熱、緩解輕中度疼痛病例。APAP過量使用或不當使用會造成嚴重的不良反應。24 h內劑量超過4 g，會引起肝毒性反應；使用劑量超過10～15 g 可迅速引起急性肝衰竭，嚴重者死亡。我國APAP 中毒的發生在近二十年呈上升趨勢，對人民的健康造成潛在威脅[8-11]。對乙酰氨基酚也是獸醫廣泛使用的解熱鎮痛藥物之一，包括家畜、家禽各種發熱疾病，如常見的呼吸道、消化道、生殖系統等細菌、病毒的感染引起體溫升高的現象。但由于部分獸醫用藥不規范，超過安全劑量或濫用乙酰氨基酚引發的中毒案例更為常見[10,12-13]。本試驗以APAP 誘導的肝損傷小鼠為模型，提取菊苣種子、根、莖及葉子4個部位多糖篩選清除自由基的能力，檢測MDA 含量、SOD、GSH、H2O2酶活及HE 染色來評價菊苣多糖對肝臟保護作用，并探討作用機理，進一步研究開發菊苣多糖的臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菊苣根、莖、葉及種子均購自新疆哈密阿薩爾生物科技有限公司，經哈密市伊州區花園鄉衛生院卡哈爾·司馬義鑒定為菊苣。

1.2 試劑與儀器

谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、谷胱甘肽（GSH）、過氧化氫酶（H2O2酶）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）及Bicinchninic Acid（BCA）蛋白試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）及標準品N-乙酰-L-半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine，NAC）購自上海源葉生物科技有限公司。

UV1900 紫外可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）、HTX 多功能微孔板檢測儀（美國伯騰儀器有限公司）。

1.3 菊苣多糖的提取

參照文獻提取菊苣種子、根、莖及葉子多糖；近紅外色譜發檢測樣品，使用苯酚-硫酸顯色法測定菊苣水提物中總多糖含量，紫外分光光度計在490 nm 處測定吸光值[2]。

1.4 DPPH清除試驗

準確稱取0.0079 g DPPH于100 mL容量瓶中，加入甲醇定容至100 mL，即濃度為0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液，置于4 ℃冰箱避光保存。將菊苣多糖溶液、NAC 溶液配制成不同濃度梯度的待測樣品液，使用GraphPad軟件計算IC50值，具體步驟參考文獻記錄[2]。

1.5 試驗設計

模型建立及動物分組和處理：昆明系小鼠，雄性、體重（18±25）g，購自新疆醫科大學實驗動物中心。試驗前適應性飼養1 周，自由進食和飲水。小鼠隨機分為7 組，每組12 只小鼠，正常對照組（NC），模型組（APAP，300 mg/kg），菊苣多糖高劑量組（H+APAP，600 mg/kg），菊苣多糖中劑量組（M+APAP，300 mg/kg），菊苣多糖低劑 量 組（L+APAP，150 mg/kg），水 飛 薊 賓 陽 性 組（APAP+S，300 mg/kg） ，菊 苣 多 糖 單 獨 組（H，600 mg/kg），正常對照組灌胃等體積蒸餾水，連續3 d。末次給藥1 h 后，正常對照組（NC）和菊苣多糖單獨組（H）外，其他組建立急性肝損傷模型，腹腔按劑量300 mg/kg 注射APAP[2]。24 h 后處死小鼠，采集血液、肝組織。各組小鼠禁食，自由飲水。

1.6 測定指標及方法

1.6.1 血清生化

給予APAP 24 h 后，采集血液。血液室溫靜置2 h，3000 r/min離心10 min，分離血清，-20 ℃保存。按照試劑盒操作方法測定ALT與AST活性。

1.6.2 肝臟生化

稱取肝組織0.2 g，用組織勻漿機冰浴勻漿，2000 r/min，4 ℃離心15 min，上清液-20 ℃保存。按照試劑盒操作方法測定MDA 含量、SOD、GSH、H2O2酶活性和蛋白質的含量。

1.6.3 病理組織切片觀察

取中性福爾馬林溶液固定組織，脫水、石蠟包埋、切片和蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察肝組織的形態結構。

1.7 數據統計與分析

數據差異顯著性通過SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，t檢驗比較各組間的差異，數值以“平均值±標準差”表示。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 菊苣多糖含量測定（見圖1）

以濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，得到回歸方程Y=14.47X-0.0159，（R2=0.9990）。

由圖1可知，其濃度在10～50 mg/L的范圍內與峰面積具有優良的線性關系。菊苣種子部位總多糖在四者之中含量最高為39%，其次莖（34%）、葉（29%）、根（28%）。

圖1 菊苣總多糖標準曲線Fig.1 Standard curve of Cichorium intybus L.total polysaccharides

2.2 菊苣四種不同部位所提取多糖的紅外光譜結果（見圖2）

圖2 菊苣多糖紅外光譜圖Fig.2 IR spectum of Cichorium intybus L.polysaccharide

由圖2 可知，在400～4000 cm-1范圍內顯出典型的多糖吸收峰。3379～3383 cm-1處為O—H 的伸縮振動[9]；1606～1616 cm-1內 的 吸 收 峰 是C=O 伸 縮 振 動 峰[10]；2930 cm-1左右的吸收峰為C—H 伸縮振動吸收峰；在1000～1200 cm-1內的3個弱吸收峰表示吡喃型糖環。

2.3 菊苣多糖對DPPH自由基的清除效果（見圖3）

圖3 菊苣4個部位多糖對DPPH的清除效果Fig.3 DPPH radical scavenging activity of Cichorium intybus L.polysaccharide

由圖3可知，隨著濃度的升高，菊苣多糖清除DPPH自由基的能力逐漸增強。當濃度為1 g/L 時，菊苣種子、葉、根、莖多糖對DPPH 自由基的最大清除率達70%、64%、48%、62%，相應的IC50值分別為0.2094、0.3713、0.3966、0.3902 mg/mL。其中，種子部位所提取的多糖對DPPH自由基的清除率最強。

2.4 菊苣種子多糖對肝功能的影響（見圖4）

圖4 菊苣種子多糖對肝功能的影響Fig.4 Effect of chicory seed polysaccharide on liver function

由圖4可知，APAP組的ALT、AST活性與NC組相比，差異極顯著（P<0.01），H 組與APAP 組相比差異極顯著（P<0.01），提示模型建立有效。其中，單項分析ALT 結果顯示，APAP+H 組、APAP+M 組、APAP+L 組與APAP 組相比差異極顯著（P<0.01）。APAP+H 組、APAP+M 組的AST活性與APAP 組相比差異極顯著（P<0.01），APAP+L 組與APAP 組相比差異顯著（P<0.05）。以上結果提示，菊苣多糖對APAP藥物性肝損傷具有潛在保護能力。

2.5 菊苣種子多糖對過氧化產物的影響（見圖5）

圖5 菊苣種子多糖對氧化反應產物的影響Fig.5 Effect of chicory seed polysaccharides on oxidation reaction products

由圖5 可知，APAP+H 組、APAP+M 組的肝組織谷胱甘肽活性與APAP 組差異極顯著（P<0.01），APAP+L 組與APAP組差異顯著（P<0.05）；APAP+H組、APAP+M組的超氧化物歧化酶活性與APAP 組差異顯著（P<0.05）；APAP+H組、APAP+M組、APAP+L組的丙二醛含量與APAP組差異極顯著（P<0.01）；APAP+H 組、APAP+M 組、APAP+L 組的過氧化氫酶活性與APAP組差異極顯著（P<0.01）。安全劑量內菊苣多糖可降低APAP引起的MDA和H2O2酶水平的損傷性升高，可改善APAP 引起的對GSH 和SOD 的消耗，從而起到一定程度的肝臟保護作用。

2.6 各組肝臟病理切片結果（見圖6）

圖6 各組肝臟病理切片結果（×400）Fig.6 The results of hepatic pathology in each group（×400）

由圖6 可知，在400 倍光鏡下觀察，NC 組和H 組中央靜脈為軸心呈放射狀排列，細胞排列緊密，無明顯差別。APAP 組發現中央靜脈周圍炎性細胞浸潤并存在出血，胞質間空隙增大，伴隨大量空泡樣結構的出現，表明APAP過量導致肝組織發生明顯的病理變化；APAP+M 組、APAP+H 組與APAP 組比較肝損傷明顯減輕，多糖治療組可顯著減緩APAP對肝細胞的損害；APAP+LAPAP治療組中可見中央靜脈周圍炎性細胞的局部浸潤及管腔壁的增厚。因此，菊苣多糖能恢復APAP引起的肝細胞破裂、肝組織毒性病理變化，證實具有明顯的保護作用。

3 討論

藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）是藥物代謝引起肝毒性或肝臟對藥物及代謝產物的變態反應所產生的消化道系統疾病。目前，DILI病例上升速度及嚴重的危害性引起藥物研究者的重視。由于服用藥物者肝臟代謝功能降低、腎功能減退，導致機體未及時代謝產生毒性反應。獸藥則對病畜產生DILI現象更為明顯，加速病畜死亡。因此，如何減緩、治愈甚至預防DILI 無疑是一個迫在眉睫的課題。對乙酰氨基酚是人、獸醫臨床常用的解熱鎮痛藥物[14-15]。該藥物在治療劑量閾值范圍內具有良好的安全性，但攝入過量可能會產生嚴重的肝毒性作用，甚至導致危及生命的急性肝衰竭（ALF）。肝臟是機體內代謝藥物的場所，藥物進入體內后于肝臟處進行代謝，用藥過量或用藥不當都會使肝臟超負荷工作而引起損傷，藥物代謝后產生的代謝毒性產物甚至會導致肝臟的急性衰竭。如過量使用APAP 即會導致劑量依賴性肝損傷，APAP 進入機體后，大部分藥物在肝臟進行代謝，包括兩種代謝途徑，即硫酸化和葡萄糖醛酸化偶聯反應及氧化成反應中間體N-乙酰對苯醌亞胺（N-acetyi-p-benzoquinone imine，NAPQI），后者與GSH 反應形成無毒代謝物。其中約65%的藥物參與葡糖醛酸化反應，約30%的藥物參與硫酸化反應，隨后產生無毒結合物隨尿液排出體外[16-17]；剩余約5%的藥物在細胞色素酶的作用下產生有毒性的中間產物NAPQI，這種APAP毒性代謝反應主要是由細胞色素P450家族2E1（CYP2E1）催化[18]。GSH 與之結合可產生無毒產物，從而緩解APAP 的毒性作用，但攝取超治療劑量的APAP會導致NAPQI的過量產生、細胞內谷胱甘肽的消耗以及NAPQI與細胞和線粒體蛋白的共價結合，從而導致核DNA損傷。線粒體的損傷使組織產生過氧化反應，過氧化產物MDA和H2O2酶的水平隨著線粒體的損傷程度增加而升高，SOD 作為一種抗氧化酶，則隨著損傷的增加而被消耗[19-21]。本試驗測定GSH、MDA、H2O2酶含量統計顯示高、中、低劑量組與模型組均表現出一定的差異性，含量統計顯示高、中劑量組與模型組差異顯著。可推測安全劑量內菊苣多糖可降低APAP引起的MDA和H2O2酶水平的損傷性升高，可改善APAP 引起的對GSH 和SOD 的消耗，從而起到一定程度的肝臟保護作用。這與上述文獻報道的研究結果一致。ALT和AST是肝臟的代表性轉氨酶，肝細胞受損時，轉氨酶釋放到血液中，使血清谷丙、谷草轉氨酶活性升高。據報道，對嚙齒動物采用APAP 過量誘導的模型普遍被認為是一種探索新的治療策略的活體動物體內實驗體系，包括對天然產物的測試[22]。菊苣多糖能有效防止肝臟細胞膜的破裂，降低APAP引起的ALT和AST的損傷性升高。本研究選取藥用植物菊苣，建立小鼠DILI模型探究菊苣的肝保護作用，為進一步挖掘菊苣藥用價值奠定基礎，為深入研究菊苣提供前期依據。

4 結論

菊苣種子、葉、根、莖多糖含量依次為39%、34%、29%、28%，自由基清楚率依次為70%、64%、48%、62%，其中種子多糖對DPPH自由基的清除率最強。菊苣多糖對APAP引起的藥物性肝損傷具有明顯的修復和緩解氧化應激反應，其高劑量多糖則更能發揮其作用，緩解APAP 造成的氧化產物水平的升高和肝組織病理變化。