鵝星狀病毒RT-PCR 檢測方法的建立

李 陽，劉英姿，李閣錦，曹祁峰，王家英，舒秀偉，周鐵忠，高慎陽*

（1. 錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121000；2. 遼寧益康生物股份有限公司，遼寧遼陽111000）

星狀病毒（astroviruses，AstV）為單股正鏈、無囊膜的RNA病毒，根據(jù)感染宿主的不同將其劃分為兩個不同的病毒屬，即哺乳動物星狀病毒和禽星狀病毒[1]。禽星狀病毒基因組全長6.9～7.9 Kb[2]。基因組包括5'UTR ORF1a、ORF1b 和ORF23 個開放閱讀框及3'UTP、多聚腺苷酸（PolyA）尾[3]。

2016年初，我國山東、江蘇、河北、江西、廣東、安徽、河南等省鵝場陸續(xù)發(fā)生雛鵝高致死性痛風(fēng)病，嚴(yán)重威脅我國養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展。鵝痛風(fēng)病主要侵害15日齡以內(nèi)的雛鵝，各品種的鵝均易感，發(fā)病高峰在10日齡前后，臨床上可致雛鵝生長發(fā)育受阻、精神沉郁、采食量減少、關(guān)節(jié)腫大，甚至死亡。死亡率可達(dá)30%～40%，飼養(yǎng)管理?xiàng)l件差的最高可達(dá)50%左右，尸檢可見全身各臟器的嚴(yán)重尿酸鹽沉積，尤以心、肝和腎較為嚴(yán)重[4-6]。研究表明，鵝星狀病毒是該次疫病的主要病原體[4]。目前，該病尚無商用化特效藥以及疫苗。防治該病的方法主要為降低飼料的蛋白質(zhì)含量、鈣磷比例及抗菌抗毒的治療。該病的傳播速度快、致死率高。因此，該病的防治在于對疾病的監(jiān)測和控制，建立一種快速、準(zhǔn)確、廉價的檢測方法對該病的防控尤為重要。

RT-PCR 檢測方法具有檢測快速、操作簡便、特異性強(qiáng)和敏感度高等特點(diǎn)。本研究根據(jù)Genbank 中GAstV 的ORF1b 保守序列，設(shè)計(jì)1 對特異性引物，建立GAstV 的RT-PCR檢測方法，為GAstV的快速診斷和流行病學(xué)的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

試驗(yàn)檢測用病料來自遼寧省營口市某鵝場，為因雛鵝痛風(fēng)而發(fā)病死亡的雛鵝心臟、肝臟、腎臟等組織。樣品采用Chu 等[7]的方法檢測為GastV 陽性后由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)試劑

病毒基因組DNA、RNA 提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、瓊脂糖、DNA 膠回收試劑盒購自TIANGEN；pMD18-T 載 體、DL2000 DNAmarker 購 自TaKaRa；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自成都福際生物技術(shù)有限公司；2×ES Taq MasterMix、ddH2O購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；雞病毒性關(guān)節(jié)炎活疫苗（ZJS 株）購自廣東溫氏大華農(nóng)生物有限公司；鵝細(xì)小病毒小鵝瘟二聯(lián)活疫苗（P1株+D株）、鴨呼腸孤病毒活疫苗（CA株）、坦布蘇病毒活疫苗（FX2010-180P株）購自易邦生物工程有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank 登錄的GAstV 病毒株（MN428642.1）ORF1b閱讀框堿基序列，利用Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)1對特異性引物GAstVF/R，預(yù)期擴(kuò)增片段為329 bp，PCR 特異性引物見表1，由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 PCR特異性引物Tab.1 The specific primers of PCR

1.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

對本實(shí)驗(yàn)室保存的陽性GAstV病料進(jìn)行RNA提取以及反轉(zhuǎn)錄，以獲得的cDNA為模板與特異性引物GAstVF/R進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)凝膠瓊脂糖電泳鑒定后，按照司廣斌等[8]的方法將目的片段進(jìn)行回收、純化、克隆。構(gòu)建pMD18-T-GAstV 重組質(zhì)粒。通過Thermo nanodrop one測定質(zhì)粒濃度，按照拷貝計(jì)算公式（質(zhì)粒濃度ng/L×6.02×1023）/（109×基因組長bp×660），計(jì)算重組質(zhì)粒拷貝數(shù)。

1.5 RT-PCR方法的建立

PCR反應(yīng)體系為30 μL，見表2。

表2 PCR反應(yīng)體系Tab.2 The reaction system of PCR

PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.6 特異性試驗(yàn)

以提取的GPV、DRV、AVAV、TMUV 的cDNA 為模板，同時設(shè)置陰性對照（ddH2O）及陽性對照（GAstV），驗(yàn)證該方法的特異性。

1.7 敏感型試驗(yàn)

將質(zhì)粒原液進(jìn)行10-2～10-8倍稀釋后分別作為模板，確定該方法的敏感性。將質(zhì)粒濃度換算成拷貝數(shù)，測得最底檢出限。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

選取3個不同批次的陽性樣品，每個樣品3個重復(fù)，進(jìn)行3次重復(fù)測定，驗(yàn)證該方法的可靠性。

1.9 模擬臨床樣品檢測

構(gòu)建10 份人工模擬病料進(jìn)行檢測限LOD 分析，樣品依次加入十倍系列（10-1～10-10）濃度稀釋的陽性質(zhì)粒，使用RNA、DNA 提取試劑盒進(jìn)行提取，利用本試驗(yàn)建立的RTPCR 方法進(jìn)行檢測，以實(shí)驗(yàn)室保存的GAstV 作為陽性對照。PCR產(chǎn)物以1.5%瓊脂凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定（見圖1）

以重組質(zhì)粒pMD18-T-GAstV 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。由圖1 可知，質(zhì)粒與陽性對照目的片段一致，表明pMD18-T-GAstV重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品鑒定結(jié)果Fig.1 The results of recombinant plasmid reference

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果（見圖2）

用本研究建立的RT-PCR 方法分別對幾種臨床常見禽病病原（GPV、DRV、AVAV、TMUV）進(jìn)行特異性檢測。由圖2 可知，僅GAstV 出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，其他病原及陰性對照均未出現(xiàn)任何條帶。表明該方法具有良好的特異性。

圖2 引物特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The results of specificity detection of the primers

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果（見圖3）

圖3 RT-PCR方法的敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The results of conformity test of RT-PCR

將質(zhì)粒原液進(jìn)行10-2～10-8倍稀釋后分別作為模板，利用本研究建立的RT-PCR 方法進(jìn)行檢測。由圖3 可知，通過Thermo nanodrop one 測定重組質(zhì)粒濃度為43.7 ng/μL，根據(jù)公式換算成拷貝數(shù)1.21×1010copies/μL。測得該方法最低檢測限可達(dá)1.21×103copies/μL。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（見圖4）

選取3 個不同批次陽性樣品，每個樣品進(jìn)行3 次重復(fù)性檢驗(yàn)。由圖4可知，擴(kuò)增產(chǎn)物亮度、位置無明顯差異，表明該方法重復(fù)性很穩(wěn)定。

圖4 RT-PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 The results of repeatability test of RT-PCR

2.5 模擬臨床樣品檢測結(jié)果（見圖5）

將10 份人工模擬樣品進(jìn)行DNA 提取后，用本研究建立的RT-PCR 方法進(jìn)行檢測。由圖5 可知，最低檢出限LOD為1.21×103copies/μL。

圖5 模擬臨床樣品檢測結(jié)果Fig.5 The results of artificial samples panels

3 討論

2016年，全國爆發(fā)高致死雛鵝痛風(fēng)病，給我國養(yǎng)鵝業(yè)帶來嚴(yán)重的影響。禽痛風(fēng)是由于尿酸產(chǎn)生過多或排泄障礙，引起的大量尿酸鹽堆積在皮下、組織、關(guān)節(jié)的一種營養(yǎng)代謝性疾病[9]。研究表明，鵝痛風(fēng)病主要是飼喂過量高蛋白、高鈣飼料引起的[10]。有學(xué)者在患病鵝體內(nèi)分離出星狀病毒，確定了真正病因[11]。由于鵝痛風(fēng)病的2 種致病因素癥狀類似，憑借臨床癥狀和病理變化很難進(jìn)行區(qū)分，給現(xiàn)場檢疫帶來困難，所以需要檢測人員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。基于TaqMan探針法檢測GAstVd的qRT-PCR方法已經(jīng)建立和應(yīng)用[12]，該方法特異性強(qiáng)，但受限于探針的合成以及qPCR儀器過于昂貴、操作復(fù)雜，不適用于基層常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測。張玉霞等[13]建立了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）檢測方法對GAstV進(jìn)行檢測，該方法能在恒溫條件下快速擴(kuò)增核酸，但是受限于試劑盒和酶的價格，加大檢測成本，不適用于大量臨床樣品檢測。為控制GAstV 疫情的流行和減少養(yǎng)鵝產(chǎn)業(yè)的損失，需要設(shè)計(jì)一種省時、可以大量檢測、廉價、操作簡單，且適用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室以及基層檢測部門的方法。在實(shí)驗(yàn)室檢測中，RT-PCR 是最常用的檢測方法，通過對核酸進(jìn)行檢測確定病毒的感染。該方法一直應(yīng)用于多種動植物病毒的檢測[14-16]。該方法簡便、易操作、檢測迅速、價格低廉，可用于大量臨床樣品的檢測，適用于基層常規(guī)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。

本研究比對GAstV ORF1b 基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)出一對特異性引物，建立一種用來檢測GAstV 的RT-PCR 方法。通過對其他幾種常見禽病進(jìn)行特異性檢測，結(jié)果顯示，擴(kuò)增出單一特異性條帶與預(yù)期目的片段大小一致，確定該方法有良好的特異性。經(jīng)敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，本研究建立的方法LOD 可達(dá)1.21×103copies/μL，確定該方法有良好的敏感性。本研究中，重復(fù)性試驗(yàn)的條帶大小、亮度均一致，確定該方法有良好的重復(fù)性；模擬臨床樣品檢測試驗(yàn)中，最低檢出限為1.21×103copies/μL。

4 結(jié)論

本研究建立的RT-PCR 方法特異性強(qiáng)、敏感的高、重復(fù)性好、成本低廉、操作簡單、可進(jìn)行大量檢測，適用于實(shí)驗(yàn)室對GAstV的病因進(jìn)行快速檢測，為基層檢測部門對疫情進(jìn)行監(jiān)測提供有效手段，同時為后續(xù)建立一種恒溫、快速檢測方法提供參考。