表沒食子兒茶素沒食子酸酯對人子宮肌瘤細胞增殖的影響及其機制▲

胡光云 關永格 宋 陽 何孝崇 孫 哲 全小明

(1 中國人民解放軍陸軍軍醫大學護理系，重慶市 400038，電子郵箱：2234381336@qq.com；2 廣州中醫藥大學第三附屬醫院婦科， 廣東省廣州市 510405;3 廣州中醫藥大學護理學院，廣東省廣州市 510405；4 廣州中醫藥大學第一附屬醫院腫瘤科， 廣東省廣州市 510405 )

子宮肌瘤是女性最常見的盆腔良性腫瘤[1]，近年來其發病率呈現出上升趨勢。60%～80%育齡期婦女患有子宮肌瘤[2]。然而，其具體病因尚未明確[3]，有研究表明子宮肌瘤是一種雌激素依賴性疾病。某些膳食成分可以改變內源性激素的代謝，發揮或擬雌激素作用，從而影響子宮肌瘤的發生[4]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)是綠茶提取物兒茶酚胺中的主要成分，EGCG可通過抗氧化活性、抑制細胞增殖、促進細胞凋亡、調控干細胞特性、抗血管生成、抑制轉移及DNA甲基化等多種方式，發揮抗腫瘤的作用[5]。有學者發現，子宮肌瘤細胞中存在Wnt信號通路的活化，抑制Wnt信號通路可抑制子宮肌瘤的生長[6]。本研究觀察EGCG對人子宮肌瘤細胞增殖的影響，并探討其相關機制，旨在為子宮肌瘤的防治提供新的思路和途徑。

1 材料和方法

1.1 標本來源 本研究所用組織標本全部取自在廣州中醫藥大學第一附屬醫院因子宮肌瘤行全子宮切除術或行子宮肌瘤剔除術的患者?；颊吣挲g35～50歲，術前至少3個月沒接受激素治療，術后病理學診斷為子宮肌瘤。手術中獲取子宮肌瘤組織后立即將其保存于含有青鏈霉素的冷Hanks溶液中，低溫轉至實驗室進行分離培養。

1.2 實驗主要設備及試劑 EGCG(Sigma公司，批號：C0130)，杜氏改良伊格爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM；Gibco公司，批號：25200-056) ， 胎牛血清(Gibco公司，批號：10270-106)， 青、鏈霉素(南京凱基生物公司，批號：15140-122)， 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(南京凱基生物公司，批號：25200-056) ， 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS；HyClone公司，SH30256.01)，Ⅰ型膠原酶(Sigma公司，批號：C0130)，相關抗體見表1。 CO2細胞培養箱(NAPCO series 5400)；LX70倒置顯微鏡(Olympus 公司，型號:CX41)；全自動拍照裝置(Lumenera公司，型號：PMZO-35)；水浴箱(Memert公司)；低速離心機(Anke公司， 型號：TDL-5c)；超低溫冰箱(SANYO公司，型號：MDF-U53V)；電子分析天平(METTLER公司，型號：AE-200)；酶標儀(Thermo公司， 型號：Multiskan MK3)；電泳、電轉系統(Bio-Rad公司)；電熱恒溫水槽(上海一恒科技有限公司，型號：DK-8D)；旋渦振蕩器(海門市麒麟醫用儀器廠，型號：QL-901)。細胞計數試劑-8(cell counting kit-8，CCK-8；Abcam公司，ab134813)；4%多聚甲醛(廣州中醫藥大學第一附屬醫院病理科自備)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自Sigma公司；羊抗鼠二抗購自中杉金橋(批號：PV-6002)。

表1 主要抗體

1.3 EGCG溶液的配置 取EGCG凍干粉，用PBS溶解，儲存濃度為2 000 μmol/L，置于4℃冰箱保存，用時稀釋為所需濃度。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞的培養與鑒定：采用改良培養方式獲取人子宮肌瘤細胞[7]。從手術室取人子宮肌瘤組織后，立即剪為1 mm左右的組織塊，將0.2% Ⅰ型膠原酶與組織塊按體積2 ∶1混勻，37℃、5% CO2培養箱中消化5～6 h，收集濾液，終止消化。過濾留濾網上的組織塊，再次消化1 h后過濾組織懸液，終止消化，收集細胞懸液。將終止消化后的細胞懸液，常溫下1 000 r/min離心5 min后棄上清，加入10%濃度培養液(DMEM+10%胎牛血清+1%青、鏈霉素)吹打均勻，再次常溫下1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入10%濃度的完全培養基接種于培養瓶中，在37℃、5% CO2培養箱中孵育培養。經免疫組化檢測鑒定后傳代培養，本研究選取第3～6代細胞進行實驗。將第3～6代細胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養，置于37℃、含5% CO2、飽和濕度的培養箱中，2～3 d換液一次。根據細胞生長狀態，每2～3 d傳代1次，取生長狀態穩定、呈對數生長期的細胞用于后續實驗。

1.4.2 實驗分組及人子宮肌瘤細胞增殖活性的檢測：取對數生長期的子宮肌瘤細胞，調整細胞密度為1×105個/mL，將細胞接種到96孔板中，培養24 h。將細胞分為對照組、50 μmol/L EGCG組、100 μmol/L EGCG組、200 μmol/L EGCG組，各劑量組分別加入相應濃度的EGCG，對照組加入同體積的PBS。另設凋零組(只有緩沖液，沒有加入細胞以及EGCG)。分別在干預24 h、48 h及72 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態后棄上清，使用PBS輕柔清洗96板孔，加入100 μL配置好的CCK8溶液，培養箱中孵育1～2 h后，于酶標儀450 nm讀取各孔的吸光度值(A)。計算細胞存活率，細胞存活率(%)=[A(加藥)-A(凋零)]/[A(對照)-A(凋零)]×100%。每組設定5 個復孔。

1.4.3 免疫組織化學法測定Wnt5b、β-Catenin蛋白表達:調整細胞濃度為1×105個/mL，接種到預先鋪好爬片的24孔板中，每孔1 mL細胞懸液。將細胞分為對照組、50 μmol/L EGCG組、100 μmol/L EGCG組、200 μmol/L EGCG組，待細胞融合達80%后，各劑量組分別加入相應濃度的EGCG，對照組加同體積的PBS。干預48 h后，棄原液，加入預冷的PBS沖洗3次，加入4%的多聚甲醛固定30 min，再棄甲醛，加入少量PBS(覆蓋玻片即可)，放入4℃冰箱中保存待用。采用常規免疫組化染色法進行檢測，以PBS代替一抗，二氨基聯苯胺顯色后應用軟件Image J觀察圖片，以Wnt5b、β-Catenin蛋白陽性表達細胞單位面積的平均光密度，代表此蛋白的表達強度。其中平均光密度是積分光密度與圖像面積的商，積分光密度是觀察區域內所用陽性表達細胞的值。實驗重復3次。

1.4.4 免疫印跡試驗測定Wnt5b、β-Catenin、EGFR蛋白表達:將處于對數生長期的細胞消化重懸，計數后調整細胞濃度為1×105個/mL，接種于6孔板中，每孔3 mL細胞懸液。將細胞分為對照組、50 μmol/L EGCG組、100 μmol/L EGCG組、200 μmol/L EGCG組。待細胞融合達80%后，各劑量組分別加入相應濃度的EGCG，對照組加同體積的PBS。藥物干預48 h后，提取細胞總蛋白，以GAPDH為內參蛋白，按25 μg/L進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白質電轉移至 NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST漂洗 6次，加入一抗(EGFR、Wnt5b稀釋比均為1 ∶1 000；β-Catenin稀釋比為1 ∶500，GAPDH稀釋比為1 ∶500)，4℃冰箱孵育過夜，TBST漂洗 6次，加入二抗 (稀釋比為1 ∶4 000 )，室溫反應2 h，TBST 漂洗6次，于Odyssey雙色紅外熒光成像系統掃描結果并分析，以目的蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值計算目的蛋白相對表達量。實驗重復3次。

1.5 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，Levene檢驗方差齊性，若方差齊，采用LSD-t法進行兩兩比較，若方差不齊，則使用Dunnett T3法進行兩兩比較；不服從正態分布的資料以M(P25，P75)表示，采用非參數統計的秩和檢驗；重復測量資料采用重復測量方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組人子宮肌瘤細胞存活率的比較 4組人子宮肌瘤細胞存活率比較，差異有統計學意義(F組間=78.929，P組間<0.001)，各干預組細胞存活率均有隨時間延長而下降的趨勢(F時間=44.753，P時間<0.001)，分組與時間有交互作用(F交互=7.213，P交互<0.001)；其中干預48 h、72 h后，對照組、50 μmol/L EGCG組、100 μmol/L EGCG組、200 μmol/L EGCG組人子宮肌瘤細胞存活率依次降低(均P<0.05)。見表2。

表2 不同時間點4組人子宮肌瘤細胞存活率的比較(x±s，%)

2.2 各組細胞形態 干預48 h后，對照組細胞呈長梭形，橢圓形細胞核位于中央，細胞融合后平行成束生長；50 μmol/L EGCG組、100 μmol/L EGCG組、200 μmol/L EGCG組的細胞形態均出現明顯的變化，細胞出現大面積的沙樣化，細胞核變化不大，但細胞輪廓及細胞之間的連接模糊不清，并大部分死亡。見圖1。

圖1 不同濃度EGCG作用人子宮肌瘤細胞48 h后形態的改變(×100)

2.3 4組人子宮肌瘤相關蛋白免疫組織化學檢測結果 各濃度EGCG干預組Wnt5b、β-Catenin蛋白表達強度均低于對照組，200 μmol/L EGCG組Wnt5b蛋白表達強度低于其他兩個濃度干預組，50 μmol/L EGCG組、100 μmol/L EGCG組、200 μmol/L EGCG組β-Catenin蛋白表達強度依次降低(均P<0.05)。見圖2、圖3、表3。

圖2 β-Catenin蛋白表達的免疫組化檢測結果(×200)

圖3 Wnt5b蛋白表達的免疫組化檢測結果(×200)

表3 各組細胞 Wnt5b、β-Catenin蛋白表達強度的比較(x±s)

2.4 4組人子宮肌瘤相關蛋白免疫印跡試驗檢測結果 各濃度EGCG干預組EGFR、β-Catenin蛋白相對表達水平均低于對照組，100、200 μmol/L EGCG組的Wnt5b蛋白相對表達水平均低于對照組(均P<0.05)；200 μmol/L EGCG組的EGFR、Wnt5b蛋白表達水平均低于其他兩個干預組(均P<0.05)。見表4和圖4。

表4 各組EGFR、Wnt5b、β-Catenin蛋白相對表達水平的比較(x±s)

圖4 4組蛋白免疫印跡試驗條帶

3 討 論

子宮肌瘤是一種常見的女性生殖系統良性腫瘤，其發病機制并未完全闡明，多種因素的相互作用可以誘導和促進子宮肌瘤的發生和發展[8]。研究表明，年齡、既往婦科炎癥史、基因、飲食習慣、社會心理因素及環境等都是影響子宮肌瘤發生的因素，其中年齡、基因等為不可抗力因素，而飲食習慣、情志因素、環境因素為可控因素，因此可從可控因素著手預防子宮肌瘤[9]。

綠茶是人們日常生活中的常見飲品，其主要成分EGCG占綠茶茶多酚的50%～75%，EGCG可以通過促進抑癌基因表達、誘導細胞凋亡、調節甲基化水平、抗血管形成、調節微小RNA表達、調節自噬活性、影響多條信號通路等途徑發揮抗腫瘤效應[10-11]，且沒有明顯的毒副作用[12]。臨床研究顯示，EGCG作為潛在的安全高效、純天然的腫瘤防治藥物，可能在預防腫瘤發生、減緩腫瘤進展、防止腫瘤復發、增強化療敏感性、減輕化療不良反應、預防化療耐藥等方面起到積極作用[13]。張秋妍[14]采用EGCG干預子宮肌瘤細胞，結果顯示，EGCG可以通過提高子宮肌瘤細胞中第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物蛋白的表達,下調磷酸化蛋白激酶B的表達,發揮抑制細胞增殖、促進凋亡的作用。

在子宮肌瘤的生長過程中存在增殖和凋亡的失衡，體內細胞的凋亡受到抑制是該病的一個重要特征[15]。研究表明，Wnt信號通路與子宮肌瘤的發生密切相關，經典信號通路Wnt/β-Catenin是子宮肌瘤發病過程的一個關鍵環節[16-18]。Wnt/β-Catenin是一個在進化上高度保守的細胞信號系統，在胚胎發育、維持器官及組織穩態方面，發揮了至關重要的作用。在一般狀態下，Wnt蛋白通過結合細胞表面受體，經跨膜受體卷曲蛋白傳遞信號給β-Catenin。大部分β-Catenin位于細胞膜，β-Catenin和其他蛋白構成無活性的復合物。經典 Wnt信號通過失活的糖原合成酶激酶抑制β-Catenin降解，β-Catenin繼而被轉運到核內[19-20],從而激活轉錄因子T細胞因子/淋巴增強因子，啟動靶基因，被激活的靶基因可引起細胞異常增殖。有研究顯示，EGFR在子宮肌瘤組織中的表達水平高于正常子宮組織，而上皮生長因子可使離體子宮肌瘤細胞迅速生長，提示上皮生長因子、EGFR與子宮肌瘤關系密切[21]。還有研究顯示[22]，EGFR可與β-Catenin信號通路相互作用，促使β-Catenin在核內聚集；同時EGFR又是β-Catenin直接的作用靶點，可減少游離β-Catenin入核。

本研究結果顯示，EGCG能有效抑制人子宮肌瘤細胞增殖，且呈一定的時間及濃度依賴性；免疫組織化學法結果顯示，Wnt5b、β-Catenin在細胞胞漿中表達，EGCG對其表達有抑制作用，且有一定的濃度依賴性。這提示EGCG可能通過抑制Wnt5b、β-Catenin蛋白的表達，發揮抑制人子宮肌瘤細胞增殖的作用。為進一步驗證該結果，我們采用免疫印跡試驗法檢測Wnt5b、β-Catenin、EGFR的表達情況。結果顯示，各濃度EGCG干預組EGFR、β-Catenin蛋白表達水平均低于對照組，100、200 μmol/L EGCG組的Wnt5b蛋白表達水平低于對照組，200 μmol/L EGCG組的EGFR、Wnt5b蛋白表達水平均低于其他兩個干預組(均P<0.05)。這提示EGCG可抑制Wnt5b、β-Catenin、EGFR蛋白的表達,且有一定的濃度依賴性。EGFR可減少游離β-Catenin入核，抑制Wnt/β-Catenin信號通路活化[23]，因此EGCG可能通過降低EGFR表達從而抑制Wnt5b、β-Catenin表達，進而抑制人子宮肌瘤細胞的增殖。

綜上所述，EGCG可能通過抑制人子宮肌瘤細胞中Wnt5b、β-Catenin、EGFR蛋白的表達，從而抑制人子宮肌瘤細胞的增殖。