E6/E7 mRNA檢測用于人乳頭狀瘤病毒16/18型陽性患者分流的可行性▲

梁 雯 白 華 林曉琰 黃麗英 黃 寧

(廣西壯族自治區婦幼保健院婦科門診，南寧市 530003，電子郵箱：1839027400@qq.com)

大量研究證實，高危型人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus,HPV)持續感染是宮頸癌發生和發展的必要條件，而其中70%的宮頸癌由高危HPV 16/18型感染引起[1-2]。因此，中國優生科學協會陰道鏡和宮頸病理學分會專家委員會在相關的指南[3]中建議，對于高危HPV 16/18型感染者，應采用立即轉診陰道鏡的措施。但是單純的HPV篩查往往敏感度高而特異度較低，其結果會對臨床進一步治療方案的制定造成干擾，相當一部分醫師會采取過度的治療方式，這會進一步影響患者的身心健康。

目前，研究表明HPV E6和E7蛋白在宮頸腫瘤的形成過程中起重要作用[4]，是在HPV致癌過程中唯一全程表達的蛋白。本研究通過對比E6/E7 mRNA檢測及液基細胞學檢查對HPV 16/18陽性患者的高級別病變的診斷效能，探討采用E6/E7 mRNA檢測方法用于分流HPV 16/18陽性患者的可行性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年12月至2018年12月在廣西壯族自治區婦幼保健院婦科門診就診的200例HPV感染患者作為研究對象。納入標準：行宮頸癌機會性篩查，經HPV分型檢測出單純HPV16或HPV18型DNA陽性。排除標準：存在宮頸癌臨床癥狀的患者。納入患者的年齡22～72(35.43±8.90)歲，其中HPV16型感染者147例，HPV18型感染者53例。本研究通過廣西壯族自治區婦幼保健院醫學倫理委員會審核通過，所有研究對象均對本研究知情理解并簽署知情同意書。

1.2 液基細胞學及高危型HPV-DNA的檢測方法 檢查前24 h禁止性行為，3 d內不可沖洗生殖道，禁止生殖道用藥。檢查時均使用一次性宮頸脫落細胞采集器，在患者的宮頸處順時針旋轉3～5周采集上皮細胞樣本，置于樣本管內多次攪拌后進行檢查。(1)使用安必平公司的全自動液基細胞制片系統進行液基細胞學制片，根據Bethesda分級系統[5]進行細胞學診斷，包括正常范圍、意義不明的不典型鱗狀細胞(atypical squamous cell of unknown significance，ASCUS)、鱗狀上皮內病變和鱗狀細胞癌，其中鱗狀上皮內病變分為低級別鱗狀上皮內病變(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)和高級別鱗狀上皮內病變(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)。以細胞學ASCUS以上設定為細胞學陽性。(2)使用Cobas 4800 HPV測試系統(PCR熒光法)檢測HPV-DNA，該檢測系統包括Cobas x480 DNA提取儀、Cobas z480實時熒光定量 PCR 儀及循環數(Ct)值自動讀取軟件平臺，Cobas HPV 檢測試劑盒購自美國羅氏公司。 嚴格按照檢測系統及相關試劑的說明書進行操作，主要步驟：首先進行全自動 DNA 提取和PCR 板加樣,然后通過 PCR 擴增儀擴增目標DNA序列；將擴增的DNA序列與相應熒光探針結合，檢測的熒光探針有4種，分別為 HPV16、HPV18、β-球蛋白和其他12種高危型HPV (HPV 31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68)探針,4種探針分別用不同顏色的熒光染料標記，通過實時測定熒光信號確定樣本中HPV種類及含量。在單次檢測中可同時檢測14種高危型HPV，以Ct值來標記病毒負荷量，若Ct值<40.0則判定為 HPV 陽性。任何一種HPV亞型陽性， 檢測結果即為陽性； 多重感染為兩種及以上 HPV 亞型同時陽性。

1.3 E6/E7 mRNA的檢測方法 檢查前要求同1.2。將采集刷置入宮頸管，旋轉，收集脫落細胞(宮頸管、宮頸口)，將采集刷置入標本瓶(含細胞保存液)，旋轉、震蕩，使細胞落入保存液中。采用支鏈DNA信號放大技術，使用Quanti VirusTMHPV E6/E7 mRNA檢測試劑盒(PCR熒光探針法，科蒂亞生物技術有限公司)檢測E6/E7 mRNA。標本經過裂解、雜交捕獲、信號放大、酶促化學發光后，使用冷光儀(科蒂亞生物技術有限公司)檢測，嚴格按照說明書進行操作。 該試劑盒可檢測世界衛生組織公布的14種高危亞型HPV E6/E7 mRNA，包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68(不分型)，超過發光閾值即為陽性。

1.4 陰道鏡檢查及宮頸活檢 在患者知情同意的情況下，由2名經過陰道鏡專業培訓的專職醫師進行陰道鏡檢查。在陰道鏡觀察異常處取活檢，如陰道鏡檢查無異常，則在3、6、9、12點方向行隨機活檢，如發現陰道鏡宮頸Ⅲ型轉化區，則行宮頸管搔刮術。將所取組織存放在10%的福爾馬林溶液中固定，做成切片后使用顯微鏡進行觀察并診斷。診斷結果分為：宮頸黏膜慢性炎；LSIL，包括宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)1、CIN2 P16(-)；HSIL，包括CIN2 P16(+)、CIN3；原位腺癌；鱗狀細胞癌；腺癌。

1.5 統計學分析 采用SPSS 23.0軟件進行統計分析。計數資料以例數(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 200例HPV 16/18型感染患者的宮頸病變檢出情況 200例HPV 16/18型感染者中，經病理確診宮頸黏膜慢性炎85例(42.5%)，LSIL[CIN1或CIN2 P16(-)]56例(28.0%)，CIN2 P16(+) 31例(15.5%)，CIN3 21例(10.5%)，宮頸鱗狀細胞癌7例(3.5%)，其中CIN2 P16(+)及以上病變檢出率為29.5%(59/200)。

2.2 200例HPV 16/18型患者的HPV E6/E7 mRNA檢測結果和液基細胞學檢測結果 200例HPV 16/18型感染患者中，共107例患者HPV E6/E7 mRNA陽性，93例陰性，其中HPV E6/E7 mRNA陽性者、陰性者的HSIL及以上病變檢出率分別為47.66%(51/107)、8.60%(8/93)，前者的檢出率高于后者(χ2=36.502，P<0.001)；共56例患者液基細胞學陽性，其中ASCUS 39例，LSIL 12例， HSIL 5例。

2.3 不同級別宮頸病變患者的HPV E6/E7 mRNA、液基細胞學檢測結果比較 隨著宮頸病變病理級別的提高，HPV E6/E7 mRNA 陽性率呈升高趨勢(均P<0.05)，但液基細胞學異常率差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 不同級別宮頸病變患者HPV E6/E7 mRNA及液基細胞學檢測結果比較[n(%)]

2.4 HPV E6/E7 mRNA及液基細胞學檢測對宮頸上皮內病變的診斷效能 以病理結果為金標準(HSIL及以上病變均歸為病理結果陽性)，評價HPV E6/E7 mRNA陽性、液基細胞學陽性診斷HSIL及以上病變的效能。HPV E6/E7 mRNA診斷HSIL及以上病變的靈敏度、特異度分別為86.44%、60.28%，液基細胞學的靈敏度、特異度分別為25.42%、70.92%，HPV E6/E7 mRNA的靈敏度高于液基細胞學(χ2=44.559，P<0.001)，兩種方法的特異度差異無統計學意義(χ2=3.536，P=0.060)，見表2、表3。

表2 E6/E7 mRNA對HSIL及以上病變的診斷結果(n)

表3 液基細胞學檢查對HSIL及以上病變的診斷結果(n)

3 討 論

感染高危型HPV是引起宮頸癌的必要條件[2]，然而大多數HPV感染后常表現為無癥狀和癥狀一過性，可在2年內被清除[6]。HPV-DNA檢測雖然具有較高的敏感度，但特異度相對較低[4]，特異性不高的根本原因在于感染普遍性以及感染后一過性感染消除的特點，檢測結果陽性只能證明曾經有過的感染，目前體內病毒是否已經清除、是否持續感染、是否會進一步導致病變及發展甚至致癌，并不能得到證實。因此HPV-DNA可能檢測出過多臨床無意義的感染，不能更好地反映宮頸細胞的病變程度。Khan等[7]發現，持續HPV16陽性，10年中17.2%的患者進展到宮頸癌前病變或宮頸癌；持續HPV18陽性，10年中13.6%的患者進展到宮頸癌前病變或宮頸癌。本研究對200例HPV 16/18型感染者進行陰道鏡活檢，結果顯示CIN2 P16(+)及以上病變檢出率僅為29.5%(59/200)，這提示對于HPV 16/18型感染的患者，積極的陰道鏡檢查可能存在過度診斷，且侵入性的活檢操作會給患者帶來不適感，并增加治療費用及患者的心理負擔，因此應該對患者進一步的分流，以避免不必要的檢查。

E6、E7蛋白分別是由E6、E7基因編碼的癌蛋白，主要存在于宿主細胞的細胞核中。E6和E7蛋白都具有獨立導致人類細胞永生化的能力，但兩者共同表達具有協同作用，可以增強轉化能力[8]。E6和E7蛋白可協同作用使得中心體復制與細胞周期脫偶聯，干擾紡錘體檢測點功能，導致中心體數目變化、分裂，改變基因組完整性，進一步導致腫瘤發生、發展[9]。E6蛋白使p53調節的G1/S節點失控，并具有抑凋亡作用、激活端粒酶作用，E7蛋白可滅活細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物pRB、p21和p27，激活細胞周期蛋白 A和E，干擾干擾素的產生，并抑制抗原遞呈， 通過這些途徑共同作用導致染色體不穩定性和基因突變等腫瘤促發事件不斷積累，使細胞永生化和轉化[10-12]。因此E6蛋白和E7蛋白在抗凋亡、調控細胞周期等方面有協同作用。

與HPV-DNA檢測不同的是，RNA檢測可以檢測到轉錄活性的病毒。在致癌作用過程中，病毒的DNA融合經常發生，引起病毒基因E2區開放讀碼框發生損壞，導致病毒癌基因E6和E7的上游調節發生異常，從而使E6和E7致癌基因表達而產生E6/E7 mRNA，進一步產生E6和E7癌蛋白；而癌蛋白可以使P53和pRB等細胞生長抑制基因失活，增加宮頸癌發生的危險性。相比于HPV-DNA，HPV E6/E7 mRNA與宮頸癌變的相關性更強，具有較高的特異性和陽性預測值。有學者提出，檢測到HPV-DNA只能說明病毒的存在，而E6/E7 mRNA表達、轉錄活性增加才具有診斷和預測價值[13]。因此，可通過檢測E6/E7的mRNA轉錄水平，監視HPV致癌基因活躍轉錄及其對宿主細胞的影響[14]。多個研究已經表明，無論對于一般人群還是已有細胞學改變的人群，使用E6/E7 mRNA篩查CINⅡ以上病變均可達到良好的效果，其對腺上皮病變也具有相當高的靈敏度。例如，Oliveira等[15]在普通人群中比較E6/E7 mRNA和雜交捕獲2代技術兩種檢測方法對于宮頸上皮內病變的診斷效能，發現前者靈敏度明顯低于后者(分別為79.3%、96.4%)，而特異度遠高于后者(分別為72.6%、42.8%)。Stoler等[16]則在939例細胞學診斷為ASCUS女性人群中同時使用E6/E7 mRNA和雜交捕獲2代技術檢測進行篩查，發現E6/E7 mRNA檢測CINⅡ以上和CINⅢ以上病變的特異度(62.6%和59.8%)均顯著高于雜交捕獲2代技術(55.8%和53.3%)，但兩者的靈敏度并無差異。同時，E6/E7 mRNA檢測與PCR檢測HPV-DNA也有相似效果。Koliopoulos等[17]發現E6/E7 mRNA陽性的ASCUS女性比HPV-DNA陽性的女性更易患CINⅡ級及以上病變；在一般人群中，E6/E7 mRNA的特異度(81.7%)高于HPV-DNA(58.6%)，但靈敏度(77.0%)低于HPV-DNA(95.0%)。Hovland等[18]則發現E6/E7 mRNA檢測對宮頸腺癌的靈敏度和特異度與HPV-DNA檢測相似，可以彌補細胞學檢查對宮頸腺上皮病變診斷靈敏度低的缺陷。本研究結果顯示，HPV E6/E7 mRNA陽性者HSIL及以上病變檢出率高于陰性者(均P<0.05)，且隨著宮頸病變病理級別的提高，HPV E6/E7 mRNA陽性率呈升高趨勢(均P<0.05)，但液基細胞學異常率差異無統計學意義(P>0.05)，這提示HPV E6/E7 mRNA陽性與宮頸病變病理級別密切相關。此外，HPV E6/E7 mRNA診斷HSIL及以上病變的靈敏度、特異度分別為86.44%、60.28%，其中靈敏度高于液基細胞學(P<0.05)，而兩種方法的特異度差異無統計學意義(P>0.05)，這提示HPV E6/E7 mRNA對于HPV 16/18型感染者的高級別病變具有較好的診斷效能，可考慮使用此檢測方法對HPV 16/18性患者進行分流，以利于減輕患者的心理負擔及損傷，降低陰道鏡轉診率，提高陰道鏡診斷率以及宮頸癌前病變及宮頸癌的檢出率。

總之，E6/E7 mRNA檢測對HPV 16/18型感染者的HSIL及以上病變具有一定的診斷效能，或可用于患者的進一步分流，以降低陰道鏡的轉診率。