冷凍鲅魚中脂肪胺的毛細管電泳分離分析

白新偉，陳文輝

(六盤水師范學院化學與材料工程學院，貴州六盤水 553004)

脂肪胺是一類毒性較大且反應活性較高的有機胺類，廣泛存在于自然界中。生物體內的蛋白質、氨基酸以及其他含氮類有機化合物都能夠通過生物降解轉化為脂肪胺。水產品在冷藏期間，也能在酶及微生物作用下從魚類肌肉組織中分解成脂肪胺[1]。脂肪胺類化合物具有毒性以及潛在的致癌性[2 - 4]，因此,如何有效地檢測冷凍海產品中脂肪胺已經成為一個重要研究課題。 目前對脂肪胺化合物分離分析最常用的方法是高效液相色譜法[5 - 7]，但色譜柱價格昂貴，有機溶劑消耗量大，分析時間長等缺點限制了該方法對脂肪胺化合物分離檢測的應用。

毛細管電泳是[8 - 12]一類以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅動力的新型液相分離技術,在脂肪胺類化合物的分離檢測領域有著廣泛的應用前景。但小分子脂肪胺大多無紫外吸收或紫外吸收較弱，所以一般采用毛細管電泳-間接紫外檢測方法[8]，但存在靈敏度低和線性范圍窄及背景吸收不穩定或基線漂移嚴重，難以保證峰形對稱等諸多缺點。為克服以上方法存在的缺陷，采用柱前或柱后衍生化是一種行之有效的手段，所以尋找合適的脂肪胺衍生試劑一直是制約毛細管電泳法測定脂肪胺的關鍵和難點 。本實驗以10-乙基吖啶酮-2-磺酰氯(EASC)作為柱前衍生試劑，獲得的衍生物性質穩定，分離度效果好，檢測靈敏度高。脂肪胺化合物標準品定性定量檢測及實際冷凍鲅魚樣品的測定實驗使毛細管電泳技術高效、快速等優勢都得以充分的體現。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

HP-3D毛細管電泳儀(美國，Agilent公司)；熔融毛細管總長58.5 cm×50 μm i.d.，有效長度為50 cm。

脂肪胺標準品：甲胺、 二甲胺、乙胺、二乙胺、丙胺、丁胺、戊胺、己胺、庚胺、辛胺(昆明聚星達化學試劑有限公司公司)；衍生試劑：10-乙基吖啶酮-2-磺酰氯(EASC)(河北建新化工股份有限公司)；乙腈(色譜純)(山東旭晨化工科技有限公司)。實驗用水為超純水。

1.2 標準品溶液的配制、衍生化及樣品預處理

脂肪胺標準品溶液：準確稱取脂肪胺標準品，用色譜純乙腈配成1.0×10-5mol/L。衍生試劑EASC溶液(1.0×10-3mol/L)：準確稱取8.1 mg EASC，溶于25 mL 無水乙腈。

標準品的衍生化:向安瓿瓶中加入20 μL脂肪胺混合標準溶液，80 μL EASC溶液，60 ℃水浴中反應3 min，稀釋2倍后，進樣10 μL分析。

實際樣品預處理：參照文獻方法[5]，冷凍鲅魚融化后取可食用部分剁碎，準確稱取 1.0 g 樣品，加入3 mL 10% 三氯乙酸，冰浴條件下于乳缽中充分研磨勻漿并定容至 5 mL，然后以 1 500 r/min 離心 3 min。取上清液加冰乙酸中和后，即為待測樣液，待用。

1.3 毛細管電泳條件

背景電解質為含15 mmol/L SDS的20 mmol/L硼酸鹽緩沖液(pH為9.2)。采用壓力進樣的方式：50 mbar×8 s。分離電壓18 kV，柱溫25 ℃，檢測波長為 219 nm。衍生后的標準溶液、樣品溶液及背景電解質溶液進樣前均用0.45 μm微孔濾膜過濾，再用超聲波脫氣10 min。每次進樣前依次用0.1 mol/L NaOH溶液、超純水和背景電解質溶液各沖洗毛細管2 min。

2 結果與討論

2.1 衍生條件的優化

實驗表明，10-乙基吖啶酮-2-磺酰氯對10種脂肪胺的衍生化產率隨反應溫度、衍生試劑用量不同而存在差異。衍生產率隨反應溫度升高，產率明顯增大。當溫度達到60 ℃時，衍生反應3 min后產物信號強度基本穩定，繼續升高溫度會引起衍生試劑輕度分解而影響衍生產率。衍生試劑的摩爾量為與樣品摩爾比為4時衍生產物的信號強度最強。衍生產物在室溫下保存，數周內色譜峰高皆無明顯變化，說明衍生產物穩定性較好。

2.2 分離條件的優化

調整硼酸鹽的濃度為10～30 mmol/L(pH 值為9.0)，對10 種脂肪胺衍生物混合標樣進行分析。硼酸鹽濃度低于15 mmol/L時，所有衍生物的信號峰較弱。硼酸鹽濃度為20 mmol/L，分離效果好。繼續增加硼酸鹽濃度，分離效果無明顯改善，以丁胺、戊胺、己胺、庚胺為例，如圖1。所以確定硼酸鹽濃度為20 mmol/L。

采用硼酸鹽溶液(20 mmol/L)，調節其pH 值為9.0～9.4，分析混合標樣。由圖2可知隨著pH[12]增加分析物之間分離度明顯改善，直至為9.2。進一步提高pH值，分離效率呈下降趨勢，選擇緩沖溶液pH為 9.2。

圖1 硼酸鹽濃度對脂肪胺標準溶液分離的影響Fig.1 Influence of borate on separation of fatty amines

圖2 pH對脂肪胺標準溶液分離的影響Fig.2 Influence of pH on separation of fatty amines

圖3 SDS對脂肪胺標準溶液分離的影響Fig.3 Influence of SDS on separation of fatty amines

表面活性劑[13,14]具有改善電滲流，提高分離效果的作用，本實驗加入表面活性劑SDS，出峰時間減少，峰形得到改善，如圖3所示。但是高濃度的SDS導致基線噪音增加，綜合比較選擇SDS濃度為15 mmol/L。

最終確定最優分離條件為：20 mmol/L硼酸鹽緩沖溶液(SDS濃度為15 mmol/L，pH為9.2)作為背景電解質，柱溫25 ℃，分離電壓18 kV。

2.3 線性范圍、檢出限和重現性

配制系列衍生化的10種脂肪胺，由高濃度到低濃度依次進樣分析，依據峰面積對其濃度的變化進行線性回歸，得到線性回歸方程及相關系數，見表1。在上述最優化條件下進行遷移時間與峰面積重現性考察，通過5次進樣實驗，遷移時間、峰面積相對標準偏差分別在0.99%～1.65%和0.86%～1.89%之間，見表1。本文方法檢出限明顯低于謝娟[5]報道的高效液相色譜法測定水產品和水發食品中 4 種脂肪胺檢出限。

2.4 實際樣品分析

取實際樣品3份，一份按“1.2”方法衍生化，直接進行定性定量分析，典型電泳譜圖見圖4，各組分含量見表2；另兩份用標準加入法進行回收率實驗，考察方法精密度，見表2。

表1 10種脂肪胺的線性方程、相關系數、線性范圍及遷移時間、峰面積相對標準偏差(RSD)

圖4 標準溶液(a)和冷凍鲅魚樣品溶液(b)電泳譜圖Fig.4 Electropherograms of standard solution(a) and sample solutions of frozen mackerel(b)R.EASC;1.methylamine;2.dimethylamine;3.ethylamine;4.diethylamine;5.propylamine;6.butyl amine;7.pentylamine;8.acetamine;9.heptamine;10.octylamine.

表2 冷凍鲅魚中脂肪胺含量及回收率

(續表2)

3 結論

實驗利用10-乙基吖啶酮-2-磺酰氯(EASC)對10種脂肪胺類化合物進行衍生化，在較短時間內實現了分析物的高效基線分離及檢測。建立的方法線性范圍寬、重現性好、操作簡便、干擾小，是一種適用于冷凍水產品中脂肪胺的定性定量快速檢測方法。