稀土元素摻雜上轉換納米材料在衛生分析領域中的應用

程嬌嬌，孟佩俊*,2，彭 微，張凌燕,2，靳 敏,2，李淑榮,2，梁青青,2，張麗萍,2，羅利霞*,2

(1.內蒙古科技大學包頭醫學院公共衛生學院，內蒙古包頭 014040；2.內蒙古自治區衛生檢測與評價工程技術中心，內蒙古包頭 014040)

1 前言

稀土元素(Rare Earth Elements，REEs)具有獨特的4f、5d電子層結構、優異的能量轉移、雙光子/多光子吸收和上轉換發光等功能，由REEs摻雜于晶體構成的稀土摻雜上轉換納米材料(REEs-UCNPs)融稀土與納米顆粒的獨特性與優異性于一體，是近年來新興的一種稀土納米熒光材料，它能夠通過能量轉移和雙光子/多光子吸收機制把近紅外光轉換成短波輻射(可見光)，其在衛生檢測等領域的應用日益廣泛。

與傳統的下轉換熒光材料(如有機染料、熒光蛋白、量子點等)相比，REEs-UCNPs具有光學/化學穩定性好、發光強度高而穩定、熒光壽命長、生物相容性好等顯著優點。另外，因近紅外光為REEs-UCNPs的激發光，將其應用于生物體內發光和成像研究，可以有效地避免生物體內自發熒光的干擾，同時對生物組織具有良好的穿透能力，且對組織和組織分子(如DNA、蛋白質等)的損傷小，能有效提高分析檢測的靈敏度和信噪比[1]。此外，REEs-UCNPs作為新興一代生物發光材料，可通過調節所摻雜的REEs的種類和基質材料，在同一波長激發光激發下實現多色上轉換發光，實現多目標物的同時標記與檢測[2]。鑒于REEs-UCNPs上述顯著優點，近些年來，基于REEs-UCNPs開發了一系列應用于衛生樣品中各種物質的分析檢測方法。本文從共振能量轉移體系構建、REEs-UCNPs表面修飾基團、檢測原理、分析方法和檢測能力等方面就REEs-UCNPs應用于衛生樣品中金屬離子、有機化合物、活性氧自由基和生物大分子等的最新分析檢測方法的研究進行了綜述。

2 REEs-UCNPs在衛生分析檢測中的應用

目前，基于REEs-UCNPs納米探針的分析檢測技術多集中于構建熒光共振能量轉移(FRET)體系或者發光共振能量轉移(LRET)體系來實現。其原理是上轉換納米材料受近紅外光激發產生的熒光被受體所猝滅，因供體相應的發射波段與受體的激發波段重疊，使供體傳遞了一部分能量而使自身熒光強度下降。由于REEs-UCNPs在980 nm近紅外光激發下能夠發出強烈的可見光，因此REEs-UCNPs被用作體系中的能量供體。其熒光激發波長為近紅外光，且在此波段中絕大部分分子無法被激發，能顯著降低生物本底熒光，提高靈敏度、降低激發光對生物體的損傷。此外，基于REEs-UCNPs的納米傳感器和熒光免疫方法也逐步興起，在物質的定性或定量檢測中應用日益廣泛。相比其他熒光材料，基于REEs-UCNPs應用與衛生樣品中各類物質的分析檢測方法均顯示出高靈敏度、高選擇性和省時簡便等顯著優勢。

2.1 金屬離子

衛生樣品中金屬離子的常規檢測方法，包括原子吸收分光光度法、原子熒光光譜法、電感耦合等離子體發射光譜法、電感耦合等離子體質譜法、電位溶出法、離子色譜法等等。但這些方法繁雜的樣品預處理、較高的儀器設備要求和存在不同程度的干擾等缺點，在一定程度上限制了他們在衛生分析領域中的普及性和快速檢測方面的適用性。近十年來，REEs-UCNPs的興起為開發簡單易行的分析檢測方法提供了新思路。在實際應用中，為提高REEs-UCNPs的水溶性及其檢測的靈敏度、選擇性，往往需要在REEs-UCNPs表面修飾不同的功能基團或者結合金納米顆粒(Au NPs)、銀納米顆粒(Ag NPs)等。常見的功能基團如鄰苯二胺(OPD)、聚乙烯亞胺、3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(TMB)等。2017年的一項研究結果顯示，在REEs-UCNPs(NaYF4∶Yb,Tm)的表面修飾OPD可用于檢測自來水中的Ag+的含量[3]，檢測限為33 nmol/L。除OPD修飾以外，Shao等[4]研究發現，支化聚乙烯亞胺功能化的REEs-UCNPs(NaYF4∶Yb,Er)通過比色和熒光檢測法，同樣可用于檢測自來水中Cu2+的含量，檢測限為45 nmol/L，具有較高的靈敏度和選擇性。Yang等[5]采用Zn2+特異性DNA酶與REEs-UCNPs(NaYF4∶Yb,Tm)結合形成納米傳感器(DNAzyme-UCNPs)，可用于檢測活細胞中的Zn2+含量，同時監測活體模型中Zn2+的動態分布情況。Vijayan等[6]同樣使用DNA功能化的REEs-UCNPs(NaYF4∶Yb,Tm)完成了對飲用水中Hg2+的定量檢測，檢測下限為0.14 nmol/L，遠低于美國環保局對飲用水中Hg2+的限量值(2 nmol/L)。同年，Meng等[7]研制了TMB功能化的REEs-UCNPs(NaYF4∶Yb,Er)上轉換納米探針，在0.217～100 μmol/L濃度范圍內對Fe3+的檢測具有高靈敏度和高選擇性，檢測限為100 μmol/L，且檢測系統的顏色變化很容易被肉眼識別。

除在REEs-UCNPs表面修飾不同功能基團外，結合Au NPs或Ag NPs的REEs-UCNPs，基于二者間的熒光共振能量轉移原理，同樣適用于衛生樣品中金屬離子的分析檢測。2018年，Liu等[8]采用長鏈適配體功能化的REEs-UCNPs(NaYF4∶Yb,Er)和短鏈適配體功能化的Au NPs，研制出一種檢測Hg2+的啟動型納米傳感器，線性范圍0.2～20 μmol/L，檢測下限為60 nmol/L，適用于自來水和牛奶樣品中Hg2+的測定。Sun等[9]選擇SiO2核殼包覆的REEs-UCNPs(NH2-NaYF4∶Yb,Er/NaYF4@SiO2)和未修飾的Au NPs，實現了飲用水中Cd2+的檢測，檢測限為59 nmol/L。同年，Chen等[10]改變了REEs-UCNPs體系，利用適配體功能化的REEs-UCNPs(NaYF4∶Gd,Yb,Ho)和磁性Fe3O4修飾的Au NPs，設計出定量檢測茶葉和廢水中Pb2+的熒光納米探針，檢測范圍為25～1 400 nmol/L，檢測限可達5.7 nmol/L。Liu等[11]改用檸檬酸鹽修飾的Ag NPs(Cit-AgNPs)與REEs-UCNPs(NaY/GdF4∶Yb,Er)混合體系，建立了一種高選擇性檢測Cr3+的無標記熒光分析方法，Cr3+檢測范圍為0.5～40 μmol/L，檢測限為34 nmol/L，可用于自來水和速溶茶樣品中Cr3+的定量分析檢測。

REEs-UCNPs在金屬離子的分析檢測方面發揮著重要作用，顯示出高靈敏度、高選擇性、省時省力，方便快速等獨特優勢。近十年內，基于REEs-UCNPs檢測金屬離子的典型研究列于表1。

表1 基于REEs-UCNPs分析檢測金屬離子典型示例

(續表1)

2.2 有機化合物

2.2.1 有機小分子日常生活中，人體每時每刻都在接觸各種有機化合物，因此建立靈敏度高、選擇性好的新型檢測方法對于滿足人們日益增長的對高品質健康生活的追求具有重要意義。2015年，Wu等[27]利用REEs-UCNPs-Au NPs之間的FRET原理，從牛奶樣品中成功檢測到三聚氰胺(MEL)的含量。REEs-UCNPs-Au NPs發生FRET效應導致熒光猝滅，當加入MEL后，Au與MEL之間的Au-N鍵結合致使Au NPs脫離UCNPs表面，進而使熒光恢復，其熒光強度與樣品中MEL含量成正比。檢測線性范圍為32～500 nmol/L，檢出限為18.0 nmol/L。同樣在食品檢測領域，Hu等[28]設計帶有酸性/PEG雜化配體的REEs-UCNPs探針，將蝦細胞置于羅丹明B(RhB)濃度大于3 μg/mL的水溶液中孵育12 h后，實現了蝦體內中RhB殘留量的快速檢測。同年，Chen等[29]利用UCNPs和方酸-鐵(SQA-Fe3+)的內過濾效應，制備出高靈敏度的用于檢測人血清中葡萄糖水平的納米傳感器，檢測葡萄糖濃度的線性范圍在7～340 μmol/L之間，檢出限為2.3 μmol/L，目前已成功應用于人血清中葡萄糖的監測。2018年，Zhao等[30]構建了REEs-UCNPs熒光探針，利用熒光猝滅機制直接檢測新鮮人血清等生物體液中的多巴胺(DA)含量。隨后，Pulgarín等[31]建立了高靈敏度共振光散射傳感器，成功從尿液中完成DA的檢測，檢測線性范圍為0～300 μmol/L，檢出限為1.62 μmol/L。

另外，農藥殘留的檢測歷來是衛生分析領域持續關注的重要課題，由于其本底含量較低，對其檢測靈敏度提出更高的要求，常規分析方法往往需要在樣品預處理階段對其進行富集，過程復雜，回收率不高。因此，開發基于REEs-UCNPs實現農藥殘留的高靈敏檢測方法具有重要意義。2019年，Wang等[32]利用乙酰膽堿酯酶(AChE)調節的UCNPs-Cu2+傳感器檢測有機磷農藥(OPs)的殘留量。其檢測原理為：Cu2+對REEs-UCNPs熒光有較強的猝滅作用，加入AChE后，其酶解產物硫代膽堿從UCNPs-Cu2+混合物中捕獲Cu2+從而熒光恢復；而OPs具有不可逆地抑制AChE活性作用，使硫代膽堿生成減少，從而降低熒光恢復。該方法檢測OPs的線性范圍為0.1～50 ng/mL，檢出限為0.05 ng/mL。2020年，Saleh等[33]利用REEs-UCNPs研制了光學傳感器膜，成功應用于農藥滅草凈殘留量的檢測，檢測線性范圍為0.23～1.5 μmol/L，檢測限為68 nmol/L，方法分析時間短，響應時間僅需7 min。

2.2.2 激素近年來，基于REEs-UCNPs快速檢測衛生樣品中激素的方法同樣得到廣泛應用。2017年，姜會聰等[34]將REEs-UCNPs偶聯單克隆抗體(mAb)形成的UCNPs-mAb探針，用于快速定量檢測牛奶中天然激素雌二醇(E2)。該方法特異性強，穩定性好，靈敏度高，檢測線性范圍為5～2 000 ng/mL，檢出限低至2.75 ng/mL。同年，基于REEs-UCNPs的免疫層析試紙條同樣適用于人工合成激素己烯雌酚的定量檢測[35]。REEs-UCNPs(NaYF4∶Yb,Er)與己烯雌酚(DES)單克隆抗體偶聯，硝酸纖維膜上的牛血清白蛋白(BSA)-DES偶聯物和羊抗鼠二抗分別為試紙條T線和C線。檢測時間僅需15 min，且檢測設備輕巧便攜，適用于食品中DES的現場大批量快速定量檢測。此外，2019年，Hu等[36]利用REEs-UCNPs與阿霉素之間FRET機制，在小鼠血液內檢測到濃度為0.005 μg/g的阿霉素，檢測靈敏度高，表明REEs-UCNPs可用于血液中阿霉素殘留的快速分析檢測。基于REEs-UCNPs應用于激素類物質的檢測方法均具有快速、便捷、高效等優點，適用于現場實時批量檢測，在衛生分析檢測領域發揮著舉足輕重的重要作用。

2.2.3 生物毒素常見的生物毒素，如赭曲霉毒素、葡萄球菌腸毒素和黃曲霉毒素等，容易通過生物鏈富集進入人體內，進而對人體健康產生嚴重危害。對生物毒素檢測的常規分析方法有薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法、酶聯免疫吸附法等。目前，基于REEs-UCNPs構建的生物傳感器檢測生物毒素的方法因其簡便、快捷、靈敏度高等優點而備受關注。赭曲霉毒素A(OTA)分布最廣、屬于與人們健康最為密切的一種生物毒素，2016年，Dai等[37]利用REEs-UCNPs和cDNA-MNPs研制出近紅外磁性適配體傳感器用于檢測OTA。檢測線性范圍為0.01～100 ng/mL，檢測限低至0.005 ng/mL。該傳感器具有較高的靈敏度和良好的選擇性，也可用于啤酒樣品中OTA的測定。在上述研究基礎上，2018年，Jo等[38]制備出檢測OTA的LRET適配體傳感器，可以在10 min內選擇性地檢測有色食品樣品中的真菌毒素，簡化了生物檢測步驟，形成高效快捷的檢測OTA新型手段。此外，葡萄球菌腸毒素B(SEB)也是一種是可以導致人體機能嚴重失調的生物毒素，Wu等[39]構建了Au NR@Pt-UCNPs適配體傳感器實現SEB的快速準確檢測，檢測線性范圍為2.0～400 pg/mL，檢測限低至0.9 pg/mL，可用于添加牛奶樣品中SEB的測定。黃曲霉毒素B1(AF B1)是已知的致癌性最強的一種生物毒素，2020年歐陽秀醞等[40]研制了UCNPs-Au NPs免疫傳感器用于食品中AF B1的快速定量檢測，檢測線性范圍為0.05～20 ng/mL，檢測限低至0.02 ng/mL，方法具有高靈敏度和高特異性。總之，基于REEs-UCNPs的生物傳感技術極大地提高了食品中生物毒素檢測的準確度和靈敏度，具有廣泛的適用性，為基于REEs-UCNPs的生物傳感技術用于其他物質的檢測方法開發提供了思路。

2.3 活性氧自由基

活性氧自由基(ROS)屬于生物體內高活性分子，包括超氧陰離子、羥自由基和過氧化氫等，由于其與人體健康關系密切，其定性定量分析是當前衛生分析領域的研究熱點之一。基于REEs-UCNPs對ROS進行活體內檢測簡便高效。2019年，Hao等[41]開發出UCNP@MOF-NiSx納米組裝體，適用于生物體內ROS的定量和選擇性檢測。在以H2O2為活細胞中ROS驗證目標時，UCNPs@MOF-NiSx成功定量監測到了生物體內的H2O2，實現了生物體內ROS的檢測功能。同年，Zhang等[42]研制出高選擇性的Ru@UCNPs納米探針，用于無背景的HOCl檢測，檢測限為0.21 μmol/L。此外，Song等[43]設計出具有超高的靈敏度的CMS-UCNPs@偶氮染料納米探針，對 ·OH進行體內外的定量檢測，檢測限低至0.10 fmol/L。2020年，Yu等[44]利用REEs-UCNPs和亞甲基藍(MB)之間的FRET原理，設計了具有高度選擇性和高靈敏度的檢測 ·OH 的探針。檢測 ·OH的濃度可通過MB氧化損傷引起的REEs-UCNPs熒光恢復的程度來確定。

2.4 生物大分子

2.4.1 核酸近些年來，對生物大分子檢測的新型檢測方法逐漸增多，基于REEs-UCNPs的高靈敏度、高特異性的核酸定量檢測與定性方法取得了一定成果。2015年，Zhu等[45]利用REEs-UCNPs與染料標記適配體之間的FRET作用，研制了檢測特定序列DNA的新型適配體傳感器。檢測靶DNA序列的線性濃度范圍為40～200 nmol/L，檢出限為2.8 nmol/L，適用于分析檢測人體唾液和血清樣本中的溶菌酶水平。隨后，2016年的一項研究顯示，表面修飾有變性牛血清蛋白的REEs-UCNPs(NaYF4∶Yb,Er)與核酸單鏈耦聯形成熒光探針，利用堿基堆積原理可對DNA進行精準檢測[46]。同年，在實現DNA精確檢測后，Kim等[47]基于REEs-UCNPs開發出新的FRET系統用于檢測CDKN2A基因的DNA甲基化水平，為后續分子診斷提供了研究基礎。

此外，利用REEs-UCNPs檢測RNA的研究也受到廣泛關注。2018年，Liu等[48]采用UCNPs@DNA共軛探針，并結合電感耦合等離子體質譜對microRNA-21(miRNA-21)進行定量檢測。0.1～500 fmol/L范圍內miRNA-21表現出很高的靈敏度，檢測下限為41 amol/L。除體外檢測miRNA外，同年，Gao等[49]在Au NPs表面包覆Pt和UCNPs顆粒形成Pt-UCNPs@Au NR體系，在活細胞中實現了胸苷激酶I miRNA的高選擇性檢測，檢測范圍1.17～65.21 fmol/10μg，檢出限為0.67 fmol/10μg。隨后，Lu等[50]采用REEs-UCNPs(NaGdF4∶Yb,Er@NaYF4)納米材料，同Au NPs和以miRNA155雙修飾互補的DNA序列耦聯，設計出UCNPs-DNA-Au NPs探針用于定量檢測miRNA155，檢測范圍為0.1～15 nmol/L，檢出限低至0.045 nmol/L。

2.4.2 蛋白質目前，基于REEs-UCNPs的蛋白質定量檢測技術已成為研究熱點之一。2015年，Zhou等[51]利用單帶REEs-UCNPs(SB-UCNPs)實現對靶向性腫瘤癌蛋白的原位定量檢測。隨后，Liang等[52]根據MnO2包覆的REEs-UCNPs同抗壞血酸之間的氧化還原反應，對堿性磷酸酶進行了定量檢測，檢測線性范圍為0.25～150 mU/mL，檢出限為0.045 mU/mL。除直接利用REEs-UCNPs進行檢測外，2016年，朱瑾等[53]開發出REEs-UCNPs熒光免疫層析試紙條，能夠快速測定血清中的降鈣素原，檢測線性范圍為0.05～50 μg/L，檢測限為0.020 μg/L，方法簡便快捷，靈敏度高、選擇性好，為實現快速檢測提供了新的研究思路。2017年，Chen等[54]基于REEs-UCNPs設計出定量檢測甲胎蛋白(AFP)的近紅外光觸發光電化學(PEC)傳感器，檢測AFP線性范圍為0.05～100 ng/mL，檢測限達0.04 ng/mL。2018年，Li等[55]采用羧基功能化的REEs-UCNPs和Ag NPs設計出夾心式單粒子計數免疫分析法，用于流室中前列腺特異性抗原的定量檢測，在Tris-Buffered生理鹽水中檢測PSA的動態范圍為0～500 pm，檢測限為1.0 pm，在血清樣本獲得的檢測限為2.3 pm，體現出該方法較高的實用性和應用范圍。

此外，基于REEs-UCNPs實現多種物質的同時分析檢測成為近年來該領域的一個研究熱點。例如，Zhan等[56]通過制備兩種大小和形貌相似、發射光譜不同的REEs-UCNPs，采用側向流動分析技術，可以快速、簡便、經濟的實現血清中降鈣素原和C反應蛋白(CRP)的雙重定量檢測，檢出限分別低至0.12 ng/mL和0.24 μg/mL。2020年，Sun等[57]基于REEs-UCNPs和Au NPs之間的FRET體系，開發出谷胱甘肽(GSH)和Cd2+的雙功能檢測系統，該體系中GSH和Cd2+的檢測限分別為0.016 μmol/L和0.059 μmol/L，具有較高的選擇性，適用于人體血漿中GSH和飲用水中Cd2+的檢測。

3 總結與展望

REEs-UCNPs作為新興一代的熒光納米探針，具備多種獨特的光/化學性質，適用于衛生樣品中多種物質的分析檢測。本文就REEs-UCNPs對衛生樣品中金屬離子、有機化合物、活性氧自由基和生物大分子等的最新分析檢測方法的研究應用和進展進行了綜述，并對基于REEs-UCNPs分析檢測金屬離子的典型示例進行了歸納總結。在這些研究中，利用REEs-UCNPs構建的FRET體系和LRET體系實現各類物質的檢測具有靈敏度高、準確度高，簡便、快速、經濟等優異特點，研究成果進展迅速，體現了REEs-UCNPs在衛生分析檢測方面的巨大優勢和在衛生分析領域中發揮著越來越突出的重要作用。

盡管REEs-UCNPs在衛生分析領域取得了一定進展，但仍面臨著諸多問題，有待深入研究。第一，相對較低的上轉換效率在一定程度上限制了其靈敏度的進一步提高。目前，提高上轉換效率是一個很大的技術挑戰，有待進一步研究探索。第二，通常情況下，為保證合成的REEs-UCNPs穩定性，其表面往往覆蓋有疏水層，為便于檢測應用，需要在后期對其進行改性，即在外表面包覆親水基團，但這一環節會在一定程度上破壞合成的REEs-UCNPs的結構并降低其熒光效率，因此開發新的水溶性好、穩定性好、可以直接應用于衛生檢測領域的REEs-UCNPs勢在必行。第三，目前對REEs-UCNPs生物安全性的研究僅僅在細胞實驗方面，動物實驗研究比較少，雖然目前的一些研究聲稱REEs-UCNPs在短期應用下不會對生物體造成較大的毒性損害，但對其長期毒性、慢性毒性及具體毒性作用機制等方面仍沒有明確的研究結果。這在一定程度上限制了REEs-UCNPs應用范圍。因此，一方面，需要對REEs-UCNPs的生物毒性進行深入研究探索；另一方面，鑒于REEs-UCNPs本身獨特的優勢，采用綠色合成方法制備生物相容性好、環保健康的REEs-UCNPs意義重大，其臨床應用未來可期。第四，將基因芯片技術、生物傳感技術、熒光免疫技術和計算機云技術等現代技術結合起來，發展基于REEs-UCNPs的傳感生物芯片，實現多組分、快速、實時、準確的定性定量分析值得期待。總之，REEs-UCNPs作為新興一代的熒光納米探針，在衛生分析檢測領域積淀了許多優異的研究成果，進一步優化改進空間巨大，具有良好的發展潛力。