高效液相色譜-串聯質譜法同時測定雞肉和雞蛋中10種硝基咪唑類藥物及代謝物

張 靜，高玉時，周 倩，馬麗娜，陸俊賢，唐修君，萬 玉，楊星星，趙 敏

(江蘇省家禽科學研究所，江蘇揚州 225125)

硝基咪唑類藥物(Nitromidazoles，NMZs)是一類具有5-硝基取代咪唑雜環結構的化合物，主要包括甲硝唑(Metronidazole，MNZ)、二甲硝唑(Dimetridazole，DMZ)、洛硝噠唑(Ronidazole，RNZ)、塞克硝唑(Secnidazole，SNZ)、異丙硝唑(Ipronidazole，IPZ)和奧硝唑(Ornidazole，ORN)等。因該類藥物具有抗菌和抗原蟲作用且療效快，曾廣泛用于殺滅及預防厭氧菌和病原蟲，同時它們還有促生長和提高飼料利用率[1]的作用。研究發現，硝基咪唑類藥物具有動物致癌性和細胞誘變毒性，歐盟、美國和日本已禁止在食源性動物中使用[2]；我國國家標準(GB 31650-2019)明確規定MNZ和DMZ允許作治療用，但在動物源性食品中不得檢出。硝基咪唑類藥物代謝迅速，主要是咪唑環上的取代基甲基被氧化成羥甲基，MNZ形成羥基甲硝唑(Metronidzole-OH，MNZOH)，DMZ和RNZ都代謝成羥基二甲硝咪唑(2-Hydroxymethyl-1-methyl-5-nitroimidazole，HMMNI)，IPZ代謝成羥基異丙硝唑(Ipronidazole-OH，IPZOH)[3]。有研究表明硝基咪唑類代謝產物在動物體內的維持時間比原藥長，并且具有和原藥類似的毒性[4]。目前獸醫中常用的有MNZ、RNZ和DMZ，但SNZ、ORN、TNZ和IPZ是繼上述三種之后療效更高，耐受性更好，不良反應較少的藥物。但未見各國對這5種藥物在動物組織中使用和殘留量作出規定，其實際應用中它們有可能替代MNZ和DMZ等應用于臨床獸醫，且它們也具有硝基咪唑類藥物的毒副作用。所以建立這7種硝基咪唑類藥物及其相應的3種代謝物殘留的檢測方法對食品安全監管是完全有必要的。

目前用于硝基咪唑類藥物及其代謝物的研究方法主要有液相色譜法(HPLC)[5,6]、氣相色譜法(GC/MS)[7 - 9]、毛細管電泳法[10,11]和液相色譜-質譜法(LC/MS)[12 - 18]。本文采用同位素內標稀釋法，利用乙酸乙酯提取，SCX固相萃取柱凈化，高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)同時測定雞肉和雞蛋中10種硝基咪唑類藥物及代謝物。方法簡單，靈敏度高，特異性強，回收率高，能夠滿足日常檢測和監督的需求。

1 實驗方法

1.1 儀器與試劑

Thermo TSQ MAX型液相色譜-三重四極桿質譜儀(美國，塞默飛公司)；固相萃取裝置(美國，Supelco公司)；N-EVAP 112氮吹儀(美國，Organomation公司)。SCX固相萃取柱(500 mg/6mL，上海安譜實驗科技股份有限公司)。

標準品：甲硝唑(MNZ)、地美硝唑(DMZ)、洛硝噠唑(RNZ)、奧硝唑(ORN)、塞克硝唑(SNZ)、羥基甲硝唑(MNZOH)、羥基二甲硝咪唑(HMMNI)、異丙硝唑(IPZ)、羥基異丙硝唑(IPZOH)、甲硝唑-D4(MNZ-D4)、地美硝唑-D3(DMZ-D3)、洛硝噠唑-D3(RNZ-D3)、奧硝唑-D3(ORN-D3)、塞克硝唑-D6(SNZ-D6)、羥基甲硝唑-D2(MNZOH-D2)、羥基二甲硝咪唑-D3(HMMNI-D3)、異丙硝唑-D3(IPZ-D3)、羥基異丙硝唑-D3(IPZOH-D3)，均購于德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度均≥98%。標準品溶液：分別準確稱取適量MNZ、DMZ、RNZ、ORN、SNZ、IPZ、IPZOH、MNZOH和HMMNI(精確到0.01 mg)，用甲醇溶解，配制成濃度為1 mg/mL的標準儲備溶液，于-20 ℃保存；內標標準溶液分別準確稱取適量MNZ-D4、DMZ-D3、RNZ-D3、ORN-D3、SNZ-D6、IPZ-D3、IPZOH-D3、MNZOH-D2和HMMNI-D3(精確到0.01mg)，用甲醇溶解，配制成濃度為1 mg/mL的內標儲備溶液，于-20 ℃保存。乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯(色譜純，德國Merck公司)；其他試劑均為分析純。水為Milli-Q系統制備的超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 樣品的制備

空白樣品為經檢驗不含上述硝基咪唑類化合物，攪碎使均勻，-20 ℃保存備用。實際樣品來源于超市、養殖場和農貿市場。

1.3 樣品前處理

準確稱取樣品2 g(精確到0.01 g)，加入100 μL 100 ng/mL硝基咪唑混合內標工作溶液，采用10 mL乙酸乙酯提取，渦旋混勻，振蕩10 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液。重復提取一次，合并上清液。上清液中加入5 mL乙睛飽和的正己烷，渦旋混勻后振蕩10 min，5 000 r/min離心5 min后，棄去正己烷。40 ℃氮氣濃縮儀吹干。加入5 mL乙酸-乙酸乙酯(5+95)混勻后備用。

凈化采用SCX固相萃取柱，5 mL乙酸-乙酸乙酯(5+95)活化，將提取液全部過柱，分別用2.5 mL丙酮，5 mL甲醇，5 mL乙睛淋洗。真空抽干，5 mL氨水-乙睛(5+95)洗脫后，45 ℃氮氣濃縮儀吹干，準確加入1.0 mL 0.1%甲酸溶液-乙睛(體積比9∶1)溶解殘渣，過0.45 μm膜，備用。

1.4 液相色譜-質譜條件

色譜條件：色譜柱：Waters C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為0.1%甲酸甲醇溶液。梯度洗脫條件為：0～1.0 min，90%A；1.0～5.0 min，90～10%A；5.0～6.0 min，10%A；6.0～6.1 min，10%～90%A；6.1～8.0 min，90%A。柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL。

質譜條件：離子源：電噴霧離子源，正離子掃描(ESI+)；檢測方式：多反應監測(MRM)模式；離子源溫度：350 ℃；電噴霧電壓：3 500 V；霧化氣壓力：35 Arb；輔助氣壓力：10 Arb；離子傳輸管溫度：350 ℃；碰撞氣：氬氣。目標分析物的定性定量離子對、碰撞電壓、離子透鏡電壓等信息見表1。

表1 硝基咪唑類藥物的信息及質譜參數優化條件

(續表1)

2 結果與討論

2.1 質譜條件和色譜條件的優化

采用直接進樣的方式將500 ng/mL的10種硝基咪唑類化合物的標準溶液，以及對應的氘代內標標準溶液注入到離子源中，在正離子模式下進行母離子全掃描，通過優化離子透鏡電壓得到最佳強度的各待測目標物的分子離子峰。以確定的分子離子峰為母離子進行二級質譜碎片離子掃描，獲得碎片離子信息，得到二級質譜圖。選取豐度高的為定量離子，另一種化合物為定性離子。內標化合物選取豐度高的為定性離子，不需定量離子。

2.2 樣品前處理方法的選擇

2.2.1 提取溶劑的選擇硝基咪唑類化合物的提取溶劑一般為乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇等單一溶劑或混合溶劑。本文比較了乙腈、甲醇、二氯甲烷-乙腈(1∶1，V/V)和乙酸乙酯等溶劑的提取效率，結果見圖1。由圖可以看出，提取溶劑對MNZOH和HMMNI的回收率影響最大，乙酸乙酯提取效率最高，分別為98.1%和80.5%。提取溶劑對其他化合物的影響不是很大，且采用乙酸乙酯提取可去除大部分親水性雜質，降低后續凈化的難度，因此選用乙酸乙酯作為提取溶劑。

2.2.2 固相萃取柱的優化本文比較了C18、HLB和SCX三種固相萃取柱對硝基咪唑化合物回收率的影響。由圖2可以看出，C18和HLB小柱對9種硝基咪唑化合物的回收率均偏低，而SCX小柱對目標化合物的回收率均在70%～115%之間，因此選用SCX固相萃取柱凈化。

2.3 基質效應(ME)評價

本研究按(空白基質匹配標準曲線斜率/純溶劑標準曲線斜率-1)×100%計算基質效應(ME)(表2)。當ME為負值時表示存在基質抑制效應，ME為正值時表示存在基質增強效應；絕對值越大基質效應越強。由表2可知，硝基咪唑類藥物及其代謝物在各基質溶液中呈現一定的基質抑制作用，其中MNZOH和HMMNI基質抑制效應較大。經過本方法凈化處理后目標化合物的基質效應均可在接受范圍內，且本文采用內標法測定實際樣品也可在一定程度上補償基質效應的影響。

圖1 提取溶劑對硝基咪唑化合物回收率的影響Fig.1 Effects of extraction solvents on the recoveries of the NIMs

圖2 不同固相萃取柱對硝基咪唑化合物回收率的影響Fig.2 Effects of SPE cartridges on the recoveries of the NIMs

表2 不同基質中硝基咪唑類藥物及其代謝基質效應評價

2.4 線性范圍、相關系數(R2)、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)

取一系列硝基咪唑類的標準工作溶液，在選定的色譜-質譜條件下進行測定。以外標內標峰面積之比Y和對應的質量濃度X(ng/mL)繪制標準曲線。結果表明，在0.5～40.0 ng/mL范圍內具有良好的線性關系，其線性方程和相關系數見表3。在空白樣品中添加標準溶液，按信噪比(S/N)等于10和3計算，本方法的定量限和檢測限見表3。

表3 硝基咪唑藥物線性范圍、線性方程、相關系數(R2)、檢測限(LOD)和定量限(LOQ)

2.5 準確度和精密度

在空白組織中添加1.0、2.0、10.0 μg/kg水平的目標分析物，每個樣品按上述方法重復測定6次，求日內精密度(RSD)；再每天測定一次，連續測定6天，求日間RSD，結果見表4。結果表明日內加標回收率在73.8%～112%之間，RSD為3.21%～11.8%；日間加標回收率在70.5%～106%之間，RSD為4.67%～14.6%。準確度和精密度能滿足相關標準[19]的要求。

2.6 實際樣品分析

應用本法測定了當地及周邊地區市場雞肉、雞蛋等60批次樣品，雞肉中無檢出；雞蛋有2份檢出MNZ、DMZ、TNZ和MNZOH，含量分別為5.7 μg/kg、3.7～423.5 μg/kg、5.2 μg/kg和3.2 μg/kg。其余樣品未檢出上述硝基咪唑類藥物。說明在雞養殖過程中，硝基咪唑類藥物存在著一定的使用率。

表4 方法的加標回收率和精密度

3 結論

本研究建立了高效液相色譜-串聯質譜法同時測定雞肉和雞蛋中7種硝基咪唑類藥物及其對應的3種羥基代謝物殘留。硝基咪唑類化合物及代謝物在0.5～40 ng/mL范圍內線性良好，方法的檢測限0.5～1.0 μg/kg。該方法簡單、準確、快速、重復性好、靈敏度高，且方法的回收率、靈敏度和定量限均能滿足目前日常監控和檢測的要求。