二甲基亞砜捕獲-高效液相色譜法測定羥基自由基

韓 瑤，李佳隆，楊亞磊，節夢蕾，景偉文

(新疆農業大學化學工程學院，新疆烏魯木齊 830052)

羥基自由基(·OH)具有非常高的氧化活性，可以與大多數有機物發生反應，反應速率達107～1010mol/(L·s)[1]，其來源主要是光反應過程。但 ·OH的壽命非常短，在水相中只有約10-9s，且自然水體表層所含 ·OH的穩態濃度為1.0×10-17～1.0×10-15mol/L[2]。由于壽命極短加上其穩態濃度通常較低，因此給定量測定水體中 ·OH的生成帶來了相當大的困難。

近年來，對有機探針DMSO測定 ·OH的有效性進行了充分的研究[14 - 16]，但是目前沒有報道將 DMSO 應用于Fe(Ⅲ)-羧酸體系中 ·OH的測定。本文嘗試通過DMSO捕獲 ·OH，并與其反應生成甲醛，產生的甲醛與衍生試劑2,4-二硝基苯肼(DNPH)反應得到衍生產物甲醛-2,4-二硝基苯腙(HCHO -DNPH)，利用高效液相色譜-紫外檢測器對衍生產物進行分離分析，并對具體的衍生化條件進行了優化，旨在建立一種簡便快捷、靈敏度高、衍生產物具有單一性，適用于光反應體系中 ·OH測定的分析方法。最后以該方法對UV-Fe(Ⅲ)-羧酸體系中經光化學反應形成的 ·OH進行了定量，為今后環境中持久性有機污染物(POPs)光降解和轉化反應的研究奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AB型高效液相色譜儀(日本，島津公司)，附SPD-M20A檢測器；OCRS-1型光化學反應儀(開封市宏興科教儀器)，配300 W汞燈；FE20型pH計(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；AL204型電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵。

甲醛標準品(100 mg/L，純度>97%)購自北京北方偉業計量技術研究院；甲醇(>99.9%，色譜純)購自Sigma-Aldrich公司；Fe(ClO4)3·xH2O、草酸、酒石酸、DMSO、DNPH購自天津光復科技發展有限公司，均為分析純(>99.5%)；HClO4(70%)、NaOH購自天津政成化學制品有限公司。實驗用水為艾柯純水儀制備的超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制甲醛標準溶液：準確移取1.00 mL甲醛標準品于10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，配制成10.00 mg/L標準儲備液，于冰箱4 ℃儲存，臨用時用超純水稀釋成不同濃度的標準工作液。

1.2.2 UV-Fe(Ⅲ)-羧酸體系中 ·OH的生成、捕獲及測定準確稱取0.0354 g(1.0×10-4mol/L)的Fe(ClO4)3·xH2O，加約900 mL超純水，攪拌至充分溶解后，按照Fe∶羧酸物質的量比為1∶10的比例分別加入草酸或酒石酸，定量加入DMSO，調節pH=3后(NaOH或HClO4)移入容量瓶中定容搖勻，將反應液倒入反應容器中，置于汞燈光化學反應儀中進行光照，定時取樣。樣品1 mL移入容量瓶中，加5 mL H3PO4-NaH2PO4緩沖溶液，2.7 mL DNPH溶液(1 mmol/L)，定容，于50 ℃下水浴30 min，冷卻至室溫后過濾，HPLC-PDA分離檢測。生成的甲醛按照上述衍生條件進行測定，根據DMSO和 ·OH的捕獲反應，如式1～3所示，2 mol的 ·OH得到 1 mol甲醛，從而計算 ·OH的生成量。

(1)

(2)

(3)

2 結果與討論

2.1 色譜條件

選定的色譜條件為：采用ODS-SP-C18色譜柱；流動相為甲醇∶水(70∶30，V/V)；等度洗脫方式；流速為0.7 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量為20 μL，檢測波長352 nm。圖1為測定體系典型色譜圖，其中圖1a為對照(沒有進行紫外光照射的溶液，取樣后按照“1.2.2”方法進行衍生化反應)，圖1b為甲醛標準色譜圖，圖1c和圖1d分別為Fe(Ⅲ)-草酸和Fe(Ⅲ)-酒石酸體系的測定結果。從圖1a可以看到，HPLC法沒有檢測到HCHO -DNPH的色譜峰，只有DNPH存在，說明對照溶液不產生本底干擾。從圖1b中可以看出，體系中DNPH及其衍生物HCHO -DNPH在12 min內完全分離，且分離度高，峰形對稱，達到測定要求。其中甲醛衍生物HCHO -DNPH的保留時間約為10.8 min。另外圖1c和圖1d的結果說明反應液中其他成分不會對測定產生干擾。

圖1 DNPH及甲醛衍生物HCHO -DNPH的色譜圖Fig.1 Chromatograms of DNPH and formaldehyde derivative HCHO -DNPHa:blank;b:formaldehyde standard solution;c:Fe(Ⅲ)-oxalic acid system;d:Fe(Ⅲ)-tartaric acid system.

2.2 衍生化反應條件

2.2.1 DPNH濃度的影響本文所用方法是通過DMSO探針捕獲 ·OH以產生特定的產物，然后利用衍生試劑對產物進行衍生，使生成穩定且適合用HPLC法進行測定的衍生產物，所以該方法的靈敏度有一部分是由衍生反應所決定的。目前較常使用的衍生試劑為DNPH[17]、乙醇[18]、五氟芐基羥胺鹽酸鹽[19]等。使用乙醇進行衍生時需要使用酸催化劑，操作與本文相比較為繁瑣；使用五氟芐基羥胺鹽酸鹽衍生時時間較長，不適用于快速測定。因此本實驗選擇DNPH作為衍生試劑。

對衍生化試劑的濃度進行了優化，實驗結果見圖2。圖2的結果顯示，當DPNH濃度在0～90 μmol/L范圍內變化時，衍生產物HCHO -DNPH的峰面積隨DPNH濃度增加而快速增加，當DNPH濃度大于180 μmol/L，衍生物的峰面積基本保持平穩。增加衍生試劑的濃度有利于衍生反應進行徹底，所以后續實驗衍生化試劑濃度控制在270 μmol/L左右。同時需要注意的是由于甲醛是一種易于氧化的揮發性化合物，因此在實際樣品測定中，取樣后應快速加入衍生試劑進行衍生化，以減小實驗誤差。

2.2.2 pH的影響使用DNPH進行甲醛的衍生化反應，應充分考慮酸度的影響，因為甲醛和DNPH只有在酸性條件下才能發生親核加成反應。在其它實驗條件相同條件下，pH的影響見圖3。由圖3可以看出，溶液pH值在2～3時，衍生物HCHO -DNPH的峰面積急劇下降，這是因為酸催化作用影響了DNPH和甲醛發生親核加成反應，在強酸條件下對酸度變化更加敏感，所以HCHO -DNPH峰面積變化較快[20]。溶液pH在3～6范圍內，酸度變化對于衍生物峰面積影響較小，且pH為4時峰面積達到最大，隨著酸度的減弱，該衍生反應對于酸度變化的敏感程度也有所減弱，因此在此段pH區間內峰面積有一個較為平穩的變化。當pH值在6～8之間時，盡管在較高的pH值下，可用的游離親核試劑較多，然而羰基反應性較差，所以峰面積迅速減小[21]。綜上所述，本實驗選擇pH為4的H3PO4-NaH2PO4緩沖溶液。

圖2 DNPH濃度對甲醛衍生化的影響Fig.2 Effect of DPNH concentration on derivatization of formaldehydeHCHO：5 μmol/L；pH=4.0；derivatization temperature：50 ℃；derivatization time：30 min.

圖3 pH對甲醛衍生化的影響Fig.3 Effect of pH on derivatization of formaldehydeHCHO：5 μmol/L；DNPH：270 μmol/L；derivatization temperature：50 ℃；derivatization time：30 min.

圖4 衍生溫度和時間對HCHO -DNPH峰面積的影響Fig.4 Effect of derivatization temperature and time on the peak area of HCHO -DNPHHCHO：5 μmol/L；DNPH：270 μmol/L；pH=4.0.

2.2.3 衍生化溫度和時間的影響對衍生化反應的溫度和時間影響的考察結果如圖4所示。由圖4可以看出，衍生溫度為70 ℃時，衍生產物HCHO -DNPH的峰面積變化波動明顯，且在反應時間段內沒有穩定的趨勢，而且在高溫下甲醛容易揮發。衍生溫度降為30 ℃和50 ℃時，HCHO -DNPH的峰面積變化比較平穩。適當提高反應溫度可加快反應速度，提高反應產率，因此選擇衍生溫度為50 ℃，反應30 min。

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性范圍、定量限和檢出限在優化的實驗條件下，甲醛濃度(X)在0.1～5 mg/L范圍內與衍生物(HCHO -DNPH)峰面積(Y)線性關系良好，擬合后的線性方程為:Y=3.05×105X-2.67×104，相關系數為0.9962。

以光照30 min后的反應液作為空白進行加標試驗(加標量0.1 mg/L，取6個獨立樣品進行測試)在儀器上的響應值為基礎，以3倍信噪比(S/N)所對應的摩爾濃度為方法的檢出限，得出甲醛的檢出限(LOD=3S/b，其中S峰面積的標準偏差，b為標準曲線的斜率)為0.0013 mmol/L，以10倍S/N所對應的摩爾濃度為方法的定量限(LOQ=10S/b)，得出甲醛的定量限為0.0045 mmol/L，則該方法對 ·OH的檢出限和定量限分別為0.0027 mmol/L和0.0090 mmol/L。

2.3.2 方法的加標回收率和精密度在高純水中加入Fe(ClO4)3·xH2O∶草酸(10∶1)，捕獲劑DMSO，并分別加入4個不同濃度水平的甲醛標準溶液，置于光反應儀中光照30 min進行加標回收率實驗。每個添加水平分別取3個獨立樣品進行衍生化，考察該方法的相關回收率和精密度，結果如表1。由表1中的結果可知，本方法具有良好的準確度和精密度。

表1 回收率及精密度實驗結果

2.4 實際樣品的測定

2.4.1 捕獲劑DMSO用量為了能完全捕獲水體在光照條件下產生的 ·OH，以及在一定程度上抑制體系中可能存在的副反應，對捕獲劑DMSO的用量進行了考察，結果如圖5所示。圖5中的結果表明，不加入捕獲劑DMSO時，檢測不到衍生產物HCHO -DNPH的存在。當DMSO濃度在0～14 mmol/L范圍內變化時，HCHO -DNPH峰面積隨DMSO濃度增加而急劇增加，當DMSO濃度大于14 mmol/L時，HCHO -DNPH峰面積幾乎沒有變化。在使用COU作為捕獲劑的高級氧化工藝中也報道了類似的結果[22]。當捕獲劑DMSO濃度超過14 mmol/L后，就足以捕獲UV-Fe(Ⅲ)-草酸體系在汞燈光照30 min下產生的 ·OH。但是由于考慮到更長的光照時間和不同反應體系的活性，故本實驗選擇捕獲劑DMSO的濃度為84 mmol/L，在此濃度捕獲劑條件下，反應體系產生的 ·OH都能夠被DMSO所捕獲，另一方面有研究表明在濃度足夠高的二甲基亞砜條件下，反應產生的另一種產物甲醇不能被氧化成甲醛[15]。所以本文采用較高濃度的DMSO。

2.4.2 UV-Fe(Ⅲ)-羧酸體系中 ·OH的光化學生成將本文建立的測定方法應用于Fe(Ⅲ)、Fe(Ⅲ)-草酸鹽配合物和Fe(Ⅲ)-酒石酸鹽配合物光解產生 ·OH的測定。在汞燈光源連續照射過程中產生 ·OH的累積濃度隨光照時間增加的變化如圖6所示。在足夠高的捕獲劑濃度下，累積的 ·OH濃度呈現出增長趨勢。

圖5 DMSO濃度對羥基自由基捕獲的影響Fig.5 Effect of DMSO concentration on the trapping of hydroxyl radicalsDNPH：270 μmol/L；derivatization temperature：50 ℃；derivatization time：30 min；pH=4.0.

圖6 不同羧酸鐵體系在汞燈模擬光源下 ·OH的生成Fig.6 The generation of hydroxyl radicals of different Fe(Ⅲ)-carboxylic acid systems under mercury lamp

0～10 min時間范圍內 ·OH的生成量迅速增加，隨后增加速度減慢。對于三種體系中測定的 ·OH濃度變化進行動力學分析，結果符合表觀零級反應動力學模型。由表2可知，在只有Fe(Ⅲ)存在的體系中 ·OH 的生成速率為 0.11 μmol/(L·min)，而在Fe(Ⅲ)-草酸和Fe(Ⅲ)-酒石酸體系中分別為0.56 μmol/(L·min)、0.50 μmol/(L·min)。該實驗結果表明，向UV-Fe(Ⅲ)體系中添加草酸或者酒石酸均顯著增強 ·OH的光化學生成，提高了反應活性，有利于提高降解有機污染物的氧化性能，這一研究結果與文獻報道[23]相一致。該結果意味著廣泛存在于自然水體中的Fe(Ⅲ)和小分子羧酸的協同作用對于有機物的降解作用是不容忽視的，其相互作用的機理有待于更深一步的研究。

表2 UV-Fe(Ⅲ)-羧酸體系 ·OH生成反應的反應動力學分析(pH=3±0.05)

3 結論

本文利用DMSO作為反應的捕獲劑，與 ·OH定量生成甲醛，甲醛和DNPH衍生成HCHO -DNPH，該衍生產物單一且穩定。在此基礎上，以高效液相色譜進行分離后定量檢測Fe(Ⅲ)催化的光反應體系中的 ·OH，并進行了方法學驗證。將該方法應用于Fe(Ⅲ)-羧酸體系中 ·OH的測定，實驗結果令人滿意。值得注意的是，當反應體系中有較多的其他有機物時，甲氧自由基可能會與其他有機物發生甲基化反應，給 ·OH 的測定帶來困難，因此本文所建立的方法不適用于有機底物較多的復雜體系中 ·OH的定量檢測。