基于銪螯合物納米粒子標記的時間分辨熒光免疫法檢測嗜水氣單胞菌

丁簫月，馮建軍，辛甜甜，郭松林，王藝磊，林 鵬

(集美大學水產學院，鰻鱺現代產業技術教育部工程研究中心，農業部東海海水健康養殖重點實驗室，福建廈門 361021)

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)可引發人類和哺乳動物敗血癥等疾病[1,2]，日本鰻鱺敗血腹水病、體表潰瘍病和腸炎病均與嗜水氣單胞菌感染有關[3,4]，因此，建立嗜水氣單胞菌檢測技術可有效預防和控制病害發生，減小病害造成的損失。酶聯免疫吸附法(ELISA)[5]和熒光免疫抗體法[6]檢測嗜水氣單胞菌已有報道，但ELISA法如果沒有生物素-鏈霉親和素的信號放大作用，其檢測限只有4.0×105CFU/mL，而熒光抗體法只是采用熒光顯微鏡半定量觀察，靈敏度更低。時間分辨熒光免疫檢測(Time -Resolved Fluorimmunoassay,TRFIA)以稀土螯合物作為標記物，而稀土螯合物的熒光壽命較長，免疫反應后，延緩測量時間，待短壽命的背景熒光完全衰變后再測量螯合物的熒光[7，8]，靈敏度比ELISA法和熒光抗體法高約兩個數量級。我們曾應用解離增強TRFIA法檢測水產養殖病原菌[9]，但該方法是用本身沒有熒光的標記物標記抗體。標記物本身即是熒光團，反應后不需要解離顯色的稀土螯合物探針已見諸于報道[10,11]，但另一種熒光標記物更具有優勢，即熒光納米粒子[12,13]。用于TRFIA的標記粒子是納米級的聚苯乙烯微粒共價包埋多個稀土螯合物分子[14]，由于納米粒子表面修飾有羧基、氨基等功能性基團，可以用來偶聯蛋白抗體進行標記。用稀土螯合物納米粒子作為標記物已在TRFIA檢測中得到應用[15,16]，主要用于可溶性小分子物質，但用于顆粒性的病原菌檢測尚未見報道。

在本文中，我們將銪螯合物納米粒子標記在嗜水氣單胞菌抗體上，采用雙抗夾心TRFIA法，建立了一種檢測嗜水氣單胞菌的新方法。結果證明納米粒子標記的TRFIA法同樣可用于顆粒性病原菌檢測。該方法線性范圍寬，檢測限為1.0×103CFU/mL，遠高于ELISA法及熒光抗體法。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

Perkins-Elmer Victor X4多標記分析儀(美國，Perkins-Elmer公司)；GE Healthcare SPA親和層析柱(美國，GE Healthcare公司)。

羧基修飾的銪螯合物熒光納米粒子(Fluoro-Max)購自美國Thermo fisher scientific公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基丁二酰亞胺(Sulfo-NHS)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)購自美國Pierce公司，其他相關試劑均為國產分析純。菌株B15獲得于病變的日本鰻鱺，并經Biolog自動生化鑒定系統(GeneⅢ)鑒定為嗜水氣單胞菌；實驗用鰻鱺購自福建莆田養殖場；兔抗嗜水氣單胞菌抗體(IgG)據文獻方法[17]制得，其效價為1∶25 600。

1.2 實驗方法

1.2.1 IgG的納米粒子標記參照納米粒子標記說明書以及文獻報道[18]，向離心管中加入20 μL納米粒子和180 μL MES緩沖液(pH=6.0，0.05 mol/L)，混合均勻后加入4 μL EDC溶液(0.1 mol/L)，迅速加入10 μL Sulfo-NHS溶液(0.05 mol/L)，室溫反應15 min，加入0.28 μL巰基乙醇，室溫反應10 min。4 ℃ 離心35 min(15 000 r/min)，去除上清液，加入200 μL 磷酸鹽緩沖液(pH=7.5，0.1 mol/L)溶解的IgG抗體，反應2 h后離心去除上清液。加入20%BSA封閉液200 μL，離心去上清后，用200 μL含有SDS的去離子水洗滌標記納米粒子三次，最后復溶于200 μL 0.05 mol/L MES緩沖液，得納米粒子-IgG溶液，4 ℃保存備用。標記效果亦根據文獻方法[18]驗證，效果良好。

1.2.2 菌株B15的納米粒子TRFIA法檢測用0.05 mol/L，pH=9.6的碳酸鹽緩沖溶液稀釋IgG，每孔加入100 μL稀釋后的IgG到96孔微孔板中，包被12 h，包被溫度37 ℃，用0.05 mol/L Tris-HCl洗滌液(pH=7.8)洗滌3次，加入3%BSA 200 μL封閉2 h，封閉溫度37 ℃，洗滌液洗滌3次，加入分析緩沖液稀釋的不同濃度嗜水氣單胞菌B15菌懸液100 μL，振動孵育1 h，孵育溫度37 ℃，洗滌液洗滌3次后，加入工作濃度的納米粒子-IgG溶液，振動孵育后再用洗滌液沖洗6次，多標記分析儀上測量時間分辨熒光(TRF)，測量參數設置如下：激發波長340 nm，發射波長615 nm，延遲時間0.4 ms，測量時間0.4 ms。樣品孔的TRF值設為P，對照孔的TRF值設為N，P/N>2時判斷為陽性，其中對照孔以分析緩沖溶液代替B15菌株。

2 結果與討論

2.1 正交試驗設計及結果分析

以P/N值為指標，抗體包被時間(A)、抗體包被濃度(B)、納米粒子-IgG的免疫反應時間(C)、納米粒子-IgG稀釋度(D)為4個因素，選擇3個水平進行L9(34)正交試驗，因素水平列于表1。

表1 正交試驗設計

正交試驗結果如表2所示，K1、K2和K3表示每個因素在三個水平下對應P/N值的和，k1、k2和k3則代表

表2 試驗方案和結果

(續表2)

三個水平所對應P/N值的平均值，R為極差，即該因素k值的極大值與極小值之差，k值越大，表示該水平的P/N值越大，水平越優，R值越大，表示該因素對P/N值的影響越大。因此，根據表2極差分析結果可知，因素A影響結果最大，D次之，因素B和C的影響結果相對較小，四個因素的影響程度依次為抗體包被時間>納米粒子-IgG稀釋度>納米粒子-IgG的免疫時間>抗體包被濃度。由k值可以得出最優組合為A2B1C2D2，即12 h抗體包被時間，0.5 μg/mL抗體包被濃度，3 h免疫時間為和1∶4 000 的納米粒子-IgG稀釋度。

圖1 正交試驗的結果驗證Fig.1 Verification of orthogonal experimental results

2.2 正交試驗結果驗證

正交試驗得出的最優組合為A2B1C2D2，但是該組合并未出現在所做9次的正交試驗設計中，為了驗證結果的準確性，在正交試驗設計的9次組合基礎上，加上該組合，一起重新進行基于納米粒子標記的TFRIA法檢測菌株B15，結果示于圖1。第10組的組合為A2B1C2D2，其P/N值最大，正交試驗確實對結果的優化具有一定的指導意義，并且可以降低篩選成本，提高篩選效率。

2.3 延遲時間的選擇

一般鑭系元素螯合物的熒光衰變時間約為0.9 ms，其它熒光團的衰變時間為1～100 μs，生物樣品中背景熒光的衰變時間只有1～10 μs[19]。為此我們考察了延遲時間在0.1～0.6 ms的TRF，發現延遲時間在0.2～0.4 ms時，TRF值最大且基本不變，因此選擇延遲時間為0.4 ms。延遲時間過短，會導致干擾熒光進入檢測器影響測定，延遲時間過長，由于鑭系元素螯合物熒光也會衰變，導致TRF減小。

2.4 重復性實驗

固定嗜水氣單胞菌濃度，采用正交試驗篩選的最優條件，隨機在同一微孔板上進行納米粒子TRFIA測定，計算平均值與標準偏差(板內變異系數=板內標準偏差/平均值×100%)。同理，在6塊微孔板上進行納米粒子TRFIA測定，計算板間變異系數[20]。得出菌株B15檢測的板內變異系數為2.70%，板間變異系數為9.62%。說明該方法穩定性好，重現性高。

2.5 特異性實驗

我們采用嗜水氣單胞菌菌株B15的抗體與其它14種病原菌菌株(包含不同血清型的嗜水氣單胞菌菌株)，進行基于銪螯合物納米粒子標記的TRFIA檢測，并同時進行菌株B15的檢測，結果見表3。嗜水氣單胞菌抗體與菌株B15有較強的陽性反應，其P/N為22.95，而與其它致病菌菌株無交叉反應，檢測結果為陰性，說明抗體特異性良好，其它菌株并不干擾B15的檢測。

2.6 工作曲線及檢測限

利用建立的納米粒子標記TRFIA法檢測不同濃度菌株B15，其TRF值隨致病菌濃度的增高而增大。分別以時間分辨熒光的對數值lgTRF為縱坐標、細菌濃度的對數值lgCFU為橫坐標，繪制標準曲線，線性范圍1.0×103～1.0×108CFU/mL，相關系數R2=0.990，以P/N>2時所對應的最小濃度為檢測限，其檢測限為1.0×103CFU/mL，遠高于ELISA[5]及法熒光抗體法[6]，相較于已經報道的解離增強TRFIA法檢測病原菌[9]，由于標記物為熒光納米顆粒，靈敏度也提高了5倍。

表3 納米粒子TRFIA測定嗜水氣單胞菌抗體的交叉反應

2.7 鰻鱺的實際樣品檢測

以腹腔注射嗜水氣單胞菌的日本鰻鱺組織樣品作為實驗組，腹腔注射生理鹽水的鰻鱺組織樣品作為對照組，建立了雙抗夾心納米粒子TRFIA法檢測嗜水氣單胞菌，以實驗組的TRF值與對照組的TRF值比值大于2(即P/N>2)時判斷為陽性。針對25個包括肝、鰓、腎、腸、肌組織在內的樣品進行了測定，結果見圖2，樣品均呈陽性，檢出率達100%，高于ELISA法(圖3，84%)。

圖2 鰻鱺樣品納米粒子TRFIA法檢測結果(1～5分別代表五條感染后的鰻鱺)Fig.2 The results of detection of A.japonica samples using nanoparticle-TRFIA(Number 1-5 represent the five infected A.japonica)

圖3 鰻鱺ELISA法樣品檢測結果(1～5分別代表五條感染后的鰻鱺)Fig.3 The results of detection of A.japonica samples using ELISA(Number 1-5 represent the five infected A.japonica)

3 結論

建立了基于銪螯合物納米粒子標記的TRFIA新方法檢測嗜水氣單胞菌，方法的檢出限提高到1.0×103CFU/mL，高于ELISA法和熒光抗體法，相較于解離增強TRFIA法，靈敏度也得到了進一步提高。檢測了25份人工感染的日本鰻鱺樣品，包括鰓、腎、腸、肝和肌肉組織，結果滿意。納米粒子標記TRTIA法檢測病原菌，在水產養殖病害防治領域有著廣闊的應用前景。