基于磷光量子點-表面印跡材料細胞色素c人工抗體的制備及其應用

楊文麗，孫曉杰，呂金枝，苗艷明

(山西師范大學生命科學學院，山西臨汾 041000)

蛋白質已成為后基因組時代生命科學和生物醫學等相關領域研究的焦點。然而，長期以來抗原-抗體識別的方法是經典的蛋白質分析方法，而量子點(Quantum Dots,QDs)，表面分子印跡聚合物(Surface Molecularly Imprinted Polymers,SMIPs)納米復合材料(QDs-人工抗體)為經典蛋白分析方法開啟了新的解決方案。QDs的粒徑大小與蛋白等生物大分子相匹配，而QDs又具備優異發光特性，因此QDs是蛋白分子的傳感的較理想材料[1,2]。但QDs對蛋白質的識別無特異性。而SMIPs是模仿自然界抗原-抗體反應原理[3,4]，對目標分子具有較高的專一識別性能[5]，且具有性質穩定、易于保存、成本低等特點[6 - 8]。

目前，有關QDs的SMIPs主要是基于QDs的熒光性質[8 - 11]，但生物樣品所具有的背景熒光干擾使其在實際應用中受到局限，由于生物樣品中磷光極為少見，因此QDs的室溫磷光(RTP)性質可以有效地避免上述情況的發生[12,13]。本研究發展了一種既具有人工抗體功能又具有室溫磷光特性的Cyt c QDs-SMIPs納米復合材料，并實現對Cyt c的選擇性識別分析。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

磷光由Cary Eclipse熒光分光光度計(美國，瓦里安有限公司)測定；pH值由pH酸度計(上海安萊立思儀器(中國)科技有限公司)測量；Mn-ZnS QDs的形貌采用JEM-2100透射電子顯微鏡(TEM)(日本，電子)測量；QDs-SMIPs形貌由SU8020場發射掃描電子顯微鏡(SEM)(日本，日立公司)測量；紫外-可見光譜通過島津UV-29100分光光度計進行測定。

3-巰基丙酸(MPA)、牛血清蛋白(BSA)和卵白蛋白(OB)購于北京百靈威科技有限公司；Na2S·9H2O購于上海源葉生物有限公司；Zn(Ac)2·2H2O和Mn(Ac)2·4H2O購于天津市科密歐化學試劑有限公司；3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、正硅酸乙酯(TEOS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)和細胞色素c(Cyt c)購于Sigma(美國)；NaOH購于天津市風船化學試劑科技有限公司。所用的試劑均為分析純，超純水(18.2 MΩ·cm)采用WaterPro超純水系統(美國Labconco公司)制備。

1.2 Mn-ZnS QDs的合成

Mn-ZnS QDs在已有文獻方法[14]的基礎上合成。簡要過程為：取100 mL 0.04 mol·L-1MPA溶液，10 mL 0.1 mol·L-1的Zn(Ac)2溶液，4 mL 0.01 mol·L-1的Mn(Ac)2溶液，加入到250 mL的三頸燒瓶中。然后用1 mol·L-1NaOH溶液將上述溶液的pH值調節至11，隔絕空氣反應30 min后，再用注射器將10 mL 0.1 mol·L-1的Na2S溶液加入到上述溶液中，密閉攪拌反應20 min。將得到的上述溶液50 ℃陳化2 h。加入同等體積的無水乙醇使QDs沉降，高速離心得到沉淀，真空干燥24 h，即可得到所需的Mn-ZnS QDs粉末。

1.3 Cyt c QDs-SMIPs人工抗體納米復合材料的合成

將5 mg的模板分子Cyt c，10 mL 1 mg·mL-1的Mn-ZnS QDs溶液，20 μL APTES依次加入到兩口燒瓶中，攪拌30 min，再加入0.10 mL TEOS溶液和0.10 mL氨水，反應12 h。將得到的QDs-SMIPs離心，并用0.5%SDS溶液洗滌。非印跡聚合物(QDs-SNIPs)的制備過程除沒加模板分子外其余步驟同上。

1.4 磷光檢測

首先制備濃度為250 μmol·L-1的Cyt c溶液，然后在比色管中依次加入500 μL 0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH=7.4)，50 μL 1 mg·mL-1QDs-SMIPs或QDs-SNIPs溶液，以及不同體積的Cyt c溶液，定容至5 mL，搖勻，反應5 min，用305 nm為激發波長測定其磷光。

2 結果與討論

2.1 磷光QDs及QDs-SMIPs的表征

由Mn-ZnS QDs的透射電鏡圖(圖1(a))可知Mn-ZnS QDs粒徑約為3.5 nm左右。該QDs的最大磷光激發峰為305 nm(圖1(b)曲線1)，最大磷光發射峰為590 nm(圖1(b),曲線2)，該室溫磷光性質由Mn2+的4T1-6A1的躍遷產生[15]，ZnS母體吸收激發光后，其電子受到激發，空穴則被Mn2+俘獲，電子和空穴各自在Mn2+上復合導致Mn2+的激發，完成三重態(4T1)到基態(6A1)的躍遷并產生橙色磷光[11,16]。

圖1 (a)Mn-ZnS QDs透射電鏡(TEM)圖；(b) Mn-ZnS QDs的激發光譜(曲線1)和發射光譜(曲線2)圖Fig.1 (a) TEM image of Mn-ZnS QDs;(b) Excitation(curve 1) and emission(curve 2) spectra of Mn-ZnS QDs

圖2(a)為QDs-SMIPs的掃描電鏡圖，由圖中可知QDs-SMIPs的粒徑明顯大于圖1(a)Mn-ZnS QDs的粒徑，表明SMIPs已經成功包覆在Mn-ZnS QDs的表面。圖2(b)為QDs-SMIPs、QDs-SNIPs和QDs的紅外光譜。1 141 cm-1處的強峰為Si-O-Si的伸縮峰，785 cm-1為Si-O的振動峰，3 142 cm-1處的峰為C-H的伸縮峰，3 440 cm-1和1 628 cm-1為N-H的伸縮振動峰，這表明QDs的表面已經包覆了印跡材料。由于QDs-SMIPs和QDs-SNIPs成分相似，所以兩者的主要吸收峰的位置也相似。

圖2 (a) QDs-SMIPs人工抗體納米復合材料的掃描電鏡(SEM)圖;(b)QDs-SMIPs、QDs-SNIPs人工抗體納米復合材料和Mn-ZnS QDs傅立葉紅外(IR)光譜圖Fig.2 (a) SEM image of QDs-SMIPs artificial antibody nanocomposites;(b) IR spectra of QDs-SMIPs，QDs-SNIPs artificial antibody nanocomposites and Mn-ZnS QDs

2.2 影響QDs-SMIPs穩定的因素

由圖3(a)可知，QDs-SMIPs的磷光強度隨著pH值的增大呈上升趨勢，pH值7.5時QDs-SMIPs的磷光強度達到最大值。且在pH為7.0～8.0范圍內相對穩定。由于生理pH值為7.4，因此將7.4作為該傳感體系的最佳pH值。QDs-SMIPs的磷光強度在80 min內(圖3(b))，及0.7 mol·L-1較高鹽濃度下(圖3(c))基本保持相對穩定。

圖3 pH值(a)、時間(b)和鹽濃度(c)對QDs-SMIPs人工抗體納米復合材料的影響Fig.3 Effects of pH (a),time (b) and salt concentration (c) on QDs-SMIPs artificial antibody nanocomposites

2.3 QDs-SMIPs的識別性能

2.3.1 QDs-SMIPs對目標蛋白的識別分析由圖4(a)可知，隨著Cyt c濃度的逐漸增加，QDs-SMIPs的磷光強度逐漸降低，且磷光猝滅強度與Cyt c濃度之間呈良好的線性關系，線性范圍為0.25～5.0 μmol·L-1，檢出限為0.015 μmol·L-1，相關系數R=0.999，相對標準偏差為3.66%。比較圖4(a)和圖4(b)，QDs-SMIPs對Cyt c的識別效果明顯優于QDs-SNIPs人工抗體納米復合材料，表明QDs-SMIPs對Cyt c具有更強的結合能力。

圖4 不同濃度Cyt c與QDs-SMIPs(a)和QDs-SNIPs(b)人工抗體納米復合材料磷光的關系Fig.4 Relationship between Cyt c concentrations and phosphorescence of QDs-SMIPs(a) and QDs-SNIPs (b) artificial antibody nanocompositesAll solutions were prepared in PBS(20 mmol·L-1,pH=7.4).

與其他納米材料檢測Cyt c方法的比較[16 - 21]見表1。本研究中的QDs-SMIPs檢測Cyt c的檢出限低于或相當于其他方法。更重要的是該方法是基于QDs的磷光性質，能夠避免生物樣品背景熒光的干擾，提高了檢測效率和檢測特異性，且減少了生物樣品復雜的前處理過程。

2.3.2 QDs-SMIPs的競爭實驗為驗證QDs-SMIPs對目標蛋白Cyt c的特異性識別能力，本研究進行了競爭實驗。由圖5(a)和圖5(b)可看出，隨著cOB/cCytc和cBSA/cCytc比值的增加，QDs-SMIPs的磷光強度變化較小，原因在于Cyt c與QDs-SMIPs表面的印跡位點相匹配，QDs-SMIPs可以特異地結合Cyt c，進而引起QDs-SMIPs明顯的室溫磷光強度變化。而競爭蛋白因為與印跡位點不匹配，結合能力較弱，因此不會明顯影響QDs-SMIPs對Cyt c識別。競爭實驗進一步證明該QDs-SMIPs對Cyt c具有較強的特異識別能力。

表1 測定Cyt c含量方法的比較

圖5 爭蛋白OB(a)和BSA(b)對QDs-SMIPs人工抗體納米復合材料識別Cyt c(5 μmol·L-1)的影響Fig.5 Effects of competitive proteins OB(a) and BSA(b) on QDs-SMIPs artificial antibody nanocomposites in Cyt c(5 μmol·L-1) identificationPBS(20 mmol·L-1,pH 7.4).

2.3.3 QDs-SMIPs的吸附-解吸性能圖6(a)為5 μmol·L-1的Cyt c蛋白質溶液經QDs-SMIPs和QDs-SNIPs吸附前后的紫外-可見光譜。吸附前(曲線1)與QDs-SNIPs吸附后Cyt c的紫外可見吸收值(曲線2)相比變化較小，但經QDs-SMIPs吸附后上清液中Cyt c的濃度明顯降低(曲線3)，依據紫外吸收光譜計算QDs-SNIPs的平均吸附容量為3.92 μmol·L-1，QDs-SMIPs的平均吸附容量為0.86 μmol·L-1(圖6(b))，說明印跡材料對模板分子具有良好的富集能力，而QDs-SNIPs由于沒有印跡位點，主要是非特異性吸附。

本研究還對QDs-SMIPs的解吸特性進行了分析。用0.5%SDS溶液洗滌吸附Cyt c后的QDs-SMIPs，并測定水相中Cyt c的最終濃度，然后通過洗脫液中Cyt c與QDs-SMIPs吸附Cyt c的量的比值計算解吸率，吸附-解吸循環5次。由圖6(c)可知，隨著吸附-解吸次數的增加，吸附率變化在92%～95%之間(圖6(c)插圖)，吸附量和解吸量呈逐漸減少趨勢。這可能與洗滌過程中QDs-SMIPs的損失有關，但總體變化都較小。以上結果表明在反復使用5次的情況下QDs-SMIPs的解吸能力基本保持穩定。

Fig.6 (a) 5 μmol·L-1的Cyt c蛋白質溶液紫外-可見光譜(曲線1)，QDs-SNIPs吸附后的紫外-可見光譜(曲線2)，QDs-SMIPs吸附后的紫外-可見光譜(曲線3)；(b)QDs-SMIPs和QDs-SNIPs吸附Cyt c的量；(c)在吸附-解吸循環5次條件下，QDs-SMIPs吸附量和解吸量以及解吸率(插圖)的變化情況Fig.6 (a) The UV-Vis spectrum of 5 μmol·L-1 Cyt c protein solution(curve 1),the UV-Vis spectrum after QDs-SNIPs adsorption(curve 2),the UV-Vis spectrum after QDs-SMIPs adsorption(curve 3)；(b) The amount of Cyt c adsorbed by QDs-SMIPs and QDs-SNIPs;(c) Under the condition of 5 cycles of adsorption-desorption,the changes of adsorption,desorption capacity and desorption rate(Illustrated) of QDs-SMIPs

2.3.4 QDs-SMIPs的干擾實驗為考察生物體樣品中的一些常見金屬離子和生物分子對QDs-SMIPs檢測體系的影響，進行了干擾實驗。將干擾物加入到QDs-SMIPs和Cyt c的混合溶液中，測量室溫磷光強度，結果表明，100 000倍Na+，10 000倍的K+、Mg2+、葡萄糖，500倍的Ca2+，0.05倍的Al3+，0.04倍的Cu2+，0.02倍的Fe3+、谷氨酸，200倍的丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸，100倍的賴氨酸，50倍的精氨酸對室溫磷光強度基本無影響，部分金屬離子(Al3+、Cu2+、Fe3+)對該檢測體系影響較大，但生物樣品中這些金屬離子含量很低，影響較小，并可通過稀釋樣品的方法進一步降低其影響。以上結果表明QDs-SMIPs檢測體系對Cyt c具有較好的選擇識別能力。

2.4 Cyt c猝滅QDs-SMIPs磷光的機理

Cyt c屬具有鐵卟啉中心的含鐵蛋白質，其中所含的Fe(Ⅲ)是一種高效的猝滅劑，具有電子傳遞功能[22]。QDs受到光激發時，Cyt c(Ⅲ)可以直接截獲受激電子轉變為Cyt c(Ⅱ)，導致QDs磷光猝滅[23,24]。過程如下：

(1)

(2)

為驗證Cyt c中的Fe(Ⅲ)是QDs磷光猝滅的原因，本研究將不同濃度的Fe2(SO4)3溶液分別加入到QDs溶液中，靜置5 min后測定QDs的磷光，表明在一定范圍內Fe(Ⅲ)與室溫磷光猝滅量ΔRTP呈良好的線性關系，由此推測QDs-SMIPs磷光猝滅的主要原因是Fe(Ⅲ)。為進一步驗證QDs的磷光猝滅是由Fe(Ⅱ) 引起，本研究將Cyt c與QDs-SMIPs反應體系進行80 ℃加熱處理，加熱處理后的Cyt c對QDs-SMIPs的猝滅強度明顯降低。這是由于經過加熱處理的Cyt c在反應過程中生成的Fe(Ⅱ)有一部分會變回Fe(Ⅲ)[25]，而未加熱處理的Cyt c在反應過程中生成的Fe(Ⅱ)不變，這進一步證明QDs-SMIPs磷光的猝滅由Cyt c中的Fe(Ⅲ)引起。

綜上得出，Cyt c(Ⅲ)結合于QDs-SMIPs表面后可截獲受激電子并轉變為Cyt c(Ⅱ)，進而阻止了受激電子和QDs內空穴的復合，導致QDs-SMIPs磷光猝滅，因此，Cyt c對QDs-SMIPs的磷光猝滅過程為光誘導的電子轉移。

2.5 樣品分析

為驗證QDs-SMIPs能否用于實際生物樣品中Cyt c含量的測定，進行了人血清和尿液樣品的加標回收實驗(尿液和血清樣品均來自健康志愿者)，樣品加標回收率在96%～104%之間，結果如3所示。

表3 血清和尿液中Cyt c的加標回收試驗

3 結論

本研究以SMIPs為人工抗體，Mn-ZnS磷光QDs為信號載體，制備了一種可對Cyt c識別分析的磷光型QDs-SMIPs人工抗體。在最佳實驗條件下，該QDs-SMIPs不僅能夠實現對Cyt c的選擇性識別分析，而且其具有的磷光特性能夠避免生物樣品背景熒光的干擾，因此該方法更適用于生物樣品中痕量Cyt c的檢測，并為其他種類蛋白質分子的分析檢測提供方法借鑒。