復合有機底物化學振蕩體系的中藥非線性電化學指紋圖譜研究

杜寶中，荊媛媛，馮祖飛，樊 花，劉廣鈞

(西安理工大學應用化學系，陜西西安，710048)

中醫藥歷經數千年的傳承與發展，在世界四大傳統醫藥體系中確立了自身獨特的理論體系，且臨床療效顯著。迄今，已有近百個國家將中醫藥用于臨床，且全球超過80%的人使用天然植物藥。然而，在國際中藥市場，我國僅占不足10%的份額，并以原料藥輸出為主[1]。究其原因，主要是目前對中藥的特質、藥性及質量控制與評價等手段多依賴于經驗，特別是對中藥的群集信息、道地性、復方等的定性定量分析缺乏科學、簡便和有效的檢測方法與手段，導致市場出現以劣充優、以假亂真等現象，嚴重制約了中藥現代化的進程。因此，開發和建立中藥安全使用、質量保障及科學鑒別的技術，已經成為中藥現代化進程中亟待解決的重要課題。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

CHI660b電化學工作站(上海辰華儀器公司)；JJ-1型電動攪拌器(常州國華電器有限公司)；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；SB224 S電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；217型雙液接飽和甘汞電極(上海精密科學儀器有限公司)；902C型鉑電極(江蘇江分電分析儀器有限公司)。

KBrO3、Ce(SO4)2·4H2O、H2SO4、丙二酸、蘋果酸。試劑均為分析純，水為去離子水。

當歸(陜西)、川穹(四川)、三棱(黑龍江)、土茯苓(安徽)、川貝(陜西)、丹參(陜西)、金銀花(湖南、陜西、河南)、金錢草(四川)、秦皮(陜西)、石膏(陜西)等，均為市售并經陜西省食品藥品監督檢驗研究院中藥室主任羅定強高級工程師鑒定。

1.2 檢測方法

控制水浴溫度為37±1 ℃，溶液總體積50 mL。向100 mL反應器中依次加入1.00 g干燥的中藥粉末(粒徑<0.15 mm)，H2SO4浸泡20 min，再每隔4 min依次加入丙二酸、蘋果酸、Ce(SO4)2，啟動攪拌，插入指示電極和參比電極，加入5 mL KBrO3溶液，記錄E-t曲線至電位振蕩消失。即可獲得中藥非線性電化學指紋圖譜。

2 結果與討論

2.1 振蕩圖譜

2.2 空白體系的穩定性

中藥電化學指紋圖譜是基于空白化學振蕩體系，以中藥化學成分對振蕩反應機理產生影響(抑制或促進)而形成的特征圖譜，所以建立穩定的空白體系是獲取可重現的指紋圖譜的關鍵。為此，將振蕩體系的各組分通過單因素實驗，考察圖譜的誘導期(t0)、振蕩期(td)、最大振幅(Amax)、振蕩周期(T)、最高電位(Emax)、最低電位(Emin)、平衡電位(Ea)7個參數(表1和圖1)。平行測定3次，相對標準偏差(RSD)≤1.58%。因此空白振蕩體系具有良好的重現性和穩定性。

表1 空白體系電化學指紋圖譜穩定性和重現性

2.3 體系組成與測試條件

實驗發現，丹參加入量與t0和T線性相關，如圖3所示。此為中藥群集信息的定量分析和質量評價提供了理論依據。

2.4 圖譜重現性

中藥指紋圖譜的特征之一，即重現性，也是其是否具有通用性和實用價值的衡量標準。為此，實驗考察了丹參電化學指紋圖譜的重現性，結果見表2。由表2可知，RSD≤1.51%，表明中藥在該振蕩體系中形成的非線性電化學指紋圖譜重現性良好。

圖1 空白體系電化學指紋圖譜Fig.1 Electrochemical fingerprint of blank system

圖2 丹參的電化學指紋圖譜Fig.2 Electrochemical fingerprint of Salviae miltiorrhizae radix et rhizoma

圖3 中藥加入量與誘導期和振蕩周期的線性關系Fig.3 Linear relationship between the dosage of traditional Chinese Medicine and induction period and oscillation period

表2 丹參電化學指紋圖譜的重現性

2.5 圖譜特異性

化學振蕩體系對外來化學物質十分敏感，諸如微量元素、生物堿、有機酸、氨基酸、多酞、維生素、酶、酮類、羥基和醚類等化合物，對振蕩圖譜(E-t曲線)的參數產生較大程度的影響；而不同中藥往往含有上述不同的微量或宏量化學物質，對誘導和振蕩反應產生的干擾或與振蕩體系中各反應物或中間體發生的作用不同，引起誘導和振蕩反應各種特征信息的變化不同，從而導致部分參數乃至整個振蕩圖譜形狀的改變。而化學振蕩反應是以有機物為振蕩底物，當振蕩器中各組分確定，只改變有機底物(中藥)的種類時，所獲振蕩波形即為該物質(中藥)的特征圖譜。

2.6 道地中藥材鑒別

道地中藥材系指質優效佳的中藥，為特定自然條件和生態環境的區域內所產的藥材，是一項辨別優質中藥材質量的獨具特色的綜合判別標準。即同種中藥因地域差異而對其藥效產生顯著影響，致使市場出現“以次充優”的現象，所以亟待建立科學、有效的鑒定方法。本法檢測了不同產地的枸杞和金銀花，同類中藥其圖譜的形狀基本相似，說明所含化學成分相同或相似，但特征參數有顯著差異(如td、T、Amax)，這與其化學成分的含量不同有關(如多糖、綠原酸)。表明電化學指紋圖譜技術可用于中藥材道地性的質量評價，不同地域中藥的電化學指紋圖譜見圖5。

圖4 不同中藥的電化學指紋圖譜Fig.4 Electrochemical fingerprint of different Chinese Medicines

圖5 不同地域中藥的電化學指紋圖譜Fig.5 Electrochemical fingerprint of traditional Chinese Medicine in different regions

2.7 不同部位中藥的指紋圖譜

眾所周知，同一中藥的不同部位在藥用上有著較大差異，或為全株入藥，或是根、莖等，由于各個部位作用趨向不同還需區別使用。如全當歸具有補血活血、通經活絡之功效，而當歸尾偏於活血和破血，當歸身偏於補血和養血；如何進行有效識別一直是困擾人們的難題。本文分別檢測了全當歸、當歸尾和當歸身的圖譜(圖6)。三者圖譜外形相似，說明所含的化學成分相似。但t0和Amax卻有明顯差異，應是化學成分及其含量存有差異所致。表明該法可用于中藥不同部位的識別與評價。

2.8 不同形態中藥的區別

中藥臨床應用有多種劑型，如水劑、膏劑、丸劑、散劑等，而最常用的是水劑。實驗模擬中藥熬制，分別取當歸汁的上清液、藥渣及當歸粉進行檢測。將二者與當歸粉的電化學指紋圖譜對比發現(圖7)，水劑圖譜的t0很短，td較長，Amax較大，即湯汁中的化學成分溶出充分、含量高。所以，中藥宜水煎服用。

圖6 當歸不同部位電化學指紋圖譜Fig.6 Electrochemical fingerprint of Angelica sinensis radix’s different parts

圖7 當歸不同形態的電化學指紋圖譜Fig.7 Electrochemical fingerprint of Angelica sinensis radix in different dosage forms

2.9 復方中藥指紋圖譜

中藥的藥效多體現在復方配伍，所謂“相生相克”。為此，探討了復方與單味中藥指紋圖譜的特征性。當歸可補血、活血、調經止痛、潤燥滑腸；川穹性溫，有活血順氣的作用，二者配伍用于活血止痛，調經理氣。黃芪性溫味甘，有補氣固表、利尿生肌，而土茯苓可解毒除濕、利關節；二者配伍能起到健脾、益氣、祛濕的功效。復方中藥的指紋圖譜如圖8所示。

圖8 復方中藥電化學指紋圖譜Fig.8 Compound mixed electrochemical fingerprint

圖9 不同添加物對丹參電化學指紋圖譜的影響Fig.9 Effect of different additives on the electrochemical fingerprint of Salvia miltiorrhiza

復方中藥指紋圖譜兼具單味中藥圖譜的特征，有相似性，但存在明顯差異，其t0明顯縮短、td延長,T、E介于二者之間，Amax增大，這應為相生配伍致使振蕩反應(藥效)加快及對體系的擾動(促進)作用增強。表明本法可對中藥復方配伍后各組分間協同效應的評價提供科學依據。

2.10 添加物對中藥指紋圖譜的影響

考察了不同添加物對中藥指紋圖譜的影響。取丹參與添加物的質量比為1∶1，振蕩反應至700 s，分別加入乙醇、咖啡及綠豆粉。結果如圖9所示。

由于丙二酸和蘋果酸可與乙醇發生酯化反應，從而阻止自催化反應的進行，咖啡的主要成分是咖啡因和鞣酸，鞣酸與藥物中的蛋白質、生物堿或重金屬鹽等起化學作用而產生沉淀，綠豆中特有的蛋白會與中藥的一些成分發生反應；以上均直接或間接的阻礙了中藥參與振蕩反應，致使體系振蕩減弱甚至停振。表明服藥期應忌飲酒和咖啡等，以保證其藥效。

2.11 單有機與復合有機底物的比較

實驗測定了丹參在單有機和復合有機底物振蕩體系中的非線性電化學指紋圖譜(圖10)。解析圖10可知，復合有機底物振蕩圖譜并非兩個單有機底物振蕩圖譜的線性疊加，與單有機底物相比較，復合有機底物體系的t0較短、td適中、Amax較大，T小，因而信息豐富、特異性強。這是由于丙二酸消除反應過程中過量的Br2，而蘋果酸不僅可以加快Br2的轉化和消耗，使Br-再生，還能將Ce4+還原成Ce3+。顯然，復合有機物之間的協同作用更大程度地提高了反應的可逆性和檢測的靈敏度，同時也為構建振蕩體系對有機底物的選擇上提供了新的思路。

圖10 單有機和復合有機底物體系的丹參電化學指紋圖譜Fig.10 Electrochemical fingerprint of Salvia miltiorrhiza in mono-organic and compound organic substrate systems

3 振蕩反應機理

化學振蕩體系對溫度十分敏感，溫度升高，反應速率加快，誘導期和振蕩周期明顯縮短。分別將ln(1/t0)和ln(1/td)對1/T直線擬合，均呈良好的線性關系，與Arrhenius公式相比較，求得誘導期和振蕩期的表觀活化能分別為25.7 kJ/moL和72.1 kJ/moL，表明二者反應機理不同。即振蕩反應包含誘導期和振蕩期兩個過程，誘導期為振蕩反應積蓄能量(電勢)，以使體系能夠發生振蕩反應，二者為因果關系。若以中藥為反應底物，則振蕩反應歷程為[11,12]：

(1)誘導反應

(1)

(2)

(3)

(4)

(2)振蕩反應

(5)

(6)

(7)

誘導期積累Br-和Ce3+，反應生成的Br2通過丙二酸和蘋果酸除去。振蕩期Br-在(5)被消耗、(7)再生；由此推測c(Br-)在振蕩期呈現先減小再增大的循環振蕩過程，應為化學振蕩反應的成因。

實驗以Br-離子選擇性電極動態監測空白體系和加藥體系中cBr-的變化(圖11和圖12)。由圖可知，在化學振蕩反應中，Br-電極響應電位隨時間呈周期性變化，驗證了機理推導的合理性。

圖11 空白振蕩體系Br-濃度變化循環圖Fig.11 The change of Br- concentration in blank oscillating system

圖12 加藥振蕩體系Br-濃度變化循環圖Fig.12 The change of Br- concentration in medicine adding oscillation system

另外，在空白體系的循環伏安圖中，Br2的還原峰為0.484 V(vs.SCE，下同)，Br-和Ce3+的氧化峰分別為0.902 V和1.184 V；當體系加入中藥后，其化學成分抑制了Ce4+/Ce3+參與化學反應，1.184 V處的氧化峰消失，同時Br-的氧化峰移至0.782 V，Br2還原峰移至0.449 V，且還原峰電流增大，氧化峰電流減小。結果表明，隨著中藥(板藍根)量的增加，Br-的氧化峰電流逐漸減小，且在0.5～1.0 g之間呈良好的線性關系(y=-0.3587x+0.4264，R2=0.9903)。佐證了“2.3”提出的用于中藥和中成藥群集化學成分定量分析的可靠性。

4 結論