熱療對巨噬細胞M2極化作用及其對肺癌細胞侵襲、遷移影響的體外實驗研究

饒紫琦，劉菁，陳炳林，鄧永然，劉文其

肺癌的發病率、病死率均居全球惡性腫瘤的首位，目前主要是以手術、放療、化療以及靶向治療為主的綜合治療，但總體生存率仍然較低。腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）一直以來被認為是癌癥的主要標志，在腫瘤的發生、發展及預后中均起著重要的作用，而巨噬細胞是TME系統中最重要的免疫炎性細胞群之一［1］。巨噬細胞由單核細胞分化而來，不同于其他免疫細胞，其最大特征是具有極強的功能異質性和可塑性，并能夠根據機體內復雜微環境中的信號被分化為不同功能的細胞亞群，即經典活化的M1型巨噬細胞與替代活化的M2型巨噬細胞［2］。M1型巨噬細胞通過分泌多種促炎性因子、趨化因子等參與炎癥和宿主免疫反應，而M2型巨噬細胞則分泌抑制性細胞因子，下調免疫應答，促進腫瘤進展［3］。然而，巨噬細胞在維持表型平衡的過程中受多種因素及機制的影響。

熱療是繼傳統治療方式后的一種新興、無創、綠色的癌癥治療方式，目前已被廣泛運用于各種腫瘤的輔助治療中，得到了許多臨床醫生及科研學者的廣泛關注［4］。熱療過去被認為可以對腫瘤細胞進行直接殺傷，通過抑制腫瘤細胞的增殖生長，促進凋亡，改善TME中的低pH值、乏氧狀態，增加腫瘤的血流灌注和氧合［5］。最近的研究發現，熱療還可以有效刺激機體產生抗腫瘤的免疫反應［6］。有研究表明，熱療不僅能直接作用于腫瘤細胞進行殺傷，還能調節機體微環境中各種免疫細胞的活性，包括T淋巴細胞、自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）和抗原提呈細胞（antigen-presenting cells，APC）等［7］。因此，推測熱療帶來的熱效應能作用于TME，調控巨噬細胞的表型及對腫瘤細胞的惡性生物學行為產生抑制作用。目前，TME以及免疫治療對于以往直接靶向治療腫瘤細胞是一種新的思路，熱療是如何改善TME、提高機體免疫反應的相關機制仍然需要通過大量的研究來探索。本研究從分子和細胞的角度初步探討熱療對M2型腫瘤相關巨噬細胞的調控作用，分析熱療抗腫瘤的免疫機制，探索熱療在治療腫瘤方面的價值。

1 材料與方法

1.1 研究時間 2019年6—12月。

1.2 材料 RAW264.7細胞（M0型巨噬細胞）購自中國科學院，由廣西醫科大學基礎實驗室保存，小鼠肺癌細胞（LLC）購自ATCC，DMEM培養液和胎牛血清購自Gibco公司，聚合酶鏈反應（PCR）引物由上海生物工程有限公司設計并合成，小鼠干擾素γ（IFN-γ）、小鼠白介素（IL）-4購自Peprotech公司，小鼠脂多糖（LPS）購自Sigma，PE標記的抗小鼠CD86〔CD86（B7-2）Monoclonal Antibody（GL1），FITC，eBioscience）〕和APC標記的抗小鼠CD206抗體〔（CD206（MMR）Monoclonal Antibody（MR6F3），APC，eBioscience）〕購自賽默飛世爾科技公司，Transwell小室及培養板、Corning Incorporated、細胞增殖活力試劑盒（CCK-8）購自Sigma公司，反轉錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應（real time quantitative PCR，RT-PCR）試劑盒購自TaKaRa公司。

1.3 方法

1.3.1 RAW264.7細胞株的培養 用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的DMEM培養基培養RAW264.7細胞，于37 ℃，5%CO2細胞恒溫培養箱中培養。

1.3.2 細胞的培養和誘導分化 RAW264.7細胞用含100 ml/L胎牛血清DMEM完全培養基培養并傳代；3×105/ml的RAW264.7細胞接種至6孔板內，24 h后移去RAW264.7細胞中的培養基，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗2次。加入IFN-γ（10 000 ng/L）、LPS（100 000 ng/L），繼續培養48 h為M1型巨噬細胞；加入IL-4（20 000 ng/L），繼續培養48 h為M2型巨噬細胞。

1.3.3 流式細胞術檢測M0、M1、M2型巨噬細胞表面標志抗原CD86、CD206表達率 收集不同誘導處理的RAW264.7細胞，用PBS清洗2次，分析表面標志抗原CD86、CD206的表達。參考抗體說明書，加入熒光素偶聯的抗體，4 ℃避光孵育30 min。對細胞內分子進行染色，先加入固定/透膜緩沖液200 μl，混勻并重懸細胞，4 ℃孵育30 min，洗滌3次，分別加入抗小鼠CD86和CD206抗體，4 ℃避光孵育30 min。PBS重懸細胞，流式細胞儀進行檢測，結果用Flow Jo 7.6.1軟件分析。

1.3.4 ELISA法檢測M0、M1、M2型巨噬細胞培養上清液中IL-10、IL-12分泌水平 按照試劑盒說明書稀釋標準品。測定450 nm波長處吸光度（OD）值。以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線，然后根據標準曲線的OD值查出相應的濃度，乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度繪制標準曲線并計算M0、M1、M2型巨噬細胞培養上清液中IL-10、IL-12分泌水平。

1.3.5 細胞熱療及分組 將細胞置于41 ℃、42 ℃、43 ℃恒溫循環水浴鍋中分別孵育1 h，然后放入37 ℃，5%CO2的培養箱中復溫繼續培養6 h后，進行后續實驗。細胞分為空白對照（37 ℃）組，熱療（41 ℃、42 ℃、43 ℃）組。

1.3.6 CCK-8法檢測熱療對M2型巨噬細胞增殖活性的影響 調整RAW264.7細胞濃度1×104/ml，加入96孔板內，200 μl/孔，貼壁過夜培養。每孔加入CCK-8溶液（5 mg/ml用PBS配制，pH 7.4），37 ℃繼續孵育4 h后終止培養。在熱療時、熱療后24、48、72 h 4個時間點測量OD值。酶聯免疫檢測儀選用450 nm波長，測定各孔OD值，計算熱療后各溫度處理組的細胞存活率。每組實驗重復3次，取其均值記錄結果。

1.3.7 RT-PCR檢測M0、M2型巨噬細胞及熱療（42 ℃）后M2型巨噬細胞Ym-1、Arg-1、Fizz-1 mRNA相對表達水平 取RAW264.7細胞，分組及誘導方法同上，貼壁生長過夜后，按照TRIzol 說明書提取細胞總RNA，按Primescript RT reagent Kit反轉錄試劑盒說明書降RNA反轉錄為cDNA。引物序列見表1，RT-PCR反應體系及條件參照SYBR Premix Ex TapTM 試劑盒（TaKaRa公司），以GAPDH 作為內參，以M0型巨噬細胞各目的基因的表達量為對照，采用2-ΔΔCT法計算mRNA 的相對表達量［8］，每組實驗重復3次。

表1 PCR引物序列Table 1 Primers for RT-PCR and their amplification size

1.3.8 Western blotting法檢測M2型巨噬細胞、熱療（42 ℃）后M2型巨噬細胞Ym-1、Arg-1、Fizz-1的蛋白相對表達水平 誘導分組〔M2型巨噬細胞、熱療（42 ℃）后M2型巨噬細胞〕干預后，提取各組細胞總蛋白，Western blotting法檢測熱療前后Ym-1、Arg-1、Fizz-1蛋白的相對表達水平。

1.3.9 Transwell法檢測LLC、LLC+M2、LLC+M2+熱療（42 ℃）中LLC的侵襲、遷移能力 誘導分組〔LLC、M2型巨噬細胞與LLC共培養（LLC+M2）、LLC+M2+熱療〕干預后，按照Transwell說明書，調整細胞濃度后種在上室，下室加入培養液，放入培養箱8 h、24 h后分別進行細胞計數，觀察M2型巨噬細胞、熱療（42 ℃）對LLC的侵襲、遷移能力的影響。

1.4 統計學方法 采用SPSS 26.0進行統計學分析。計量資料采用（±s）表示，每組實驗重復3次，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同誘導分化狀態下的巨噬細胞形態 顯微鏡下觀察到M1型巨噬細胞形態，24 h后開始向周圍放射狀生長并伸出偽足，胞體由圓形變成紡錘狀、梭形，細胞體積較M0型巨噬細胞大，在培養液中半貼壁生長；M2型巨噬細胞的體積較M0型巨噬細胞大，形狀呈或類似成纖維狀，偽足較M1型巨噬細胞短，呈聚團生長（見圖1）。

圖1 不同誘導分化狀態下的巨噬細胞形態（結晶紫染色，×200）Figure 1 Macrophages morphology in different activation states

2.2 流式細胞術檢測M0、M1、M2型巨噬細胞表面標志抗原CD86、CD206表達率 不同激活狀態巨噬細胞M0、M1和M2 CD86表達率分別為6.13%±1.83%、3.24%±0.76%和16.46%±3.11%。M2型巨噬細胞CD86表達率高于M0、M1型巨噬細胞，差異均有統計學意義（P＜0.001， 見 圖 2）。M0、M1、M2型 巨 噬 細 胞CD206的表達率分別為3.87%±1.02%、1.01%±0.57%和41.83%±6.73%。M2型巨噬細胞CD206表達率高于M0、M1型巨噬細胞，差異均有統計學意義（P＜0.001，見圖3）。

圖2 不同誘導分化狀態下巨噬細胞中CD86表達情況Figure 2 CD86 expression of different activated macrophages

圖3 不同誘導分化狀態下巨噬細胞中CD206表達情況Figure 3 CD206 expression of different activated macrophages

2.3 ELISA法檢測M0、M1、M2型巨噬細胞培養上清液中IL-10、IL-12分泌水平 ELISA法檢測結果顯示，M0、M1、M2型巨噬細胞上清液中培養IL-10分泌水平分別為（670±50）ng/L、（619±42）ng/L、（770±46）ng/L，IL-12分泌水平分別為（33±2）ng/L、（49±3）ng/L、（41±2）ng/L。M2型巨噬細胞IL-10分泌水平較M0和M1型巨噬細胞高，差異均有統計學意義（P＜0.001）；M1型巨噬細胞IL-12分泌水平較M0和M2型巨噬細胞高，差異均有統計學意義（P＜0.001，見圖4）。

圖4 不同誘導活化狀態下巨噬細胞IL-10與IL-12的分泌水平Figure 4 The secretion levels of IL-10 and IL-12 in macrophages under different activation states

2.4 CCK-8法檢測熱療（42 ℃）后M2巨噬細胞增殖活性 熱療后（41 ℃、42 ℃、43 ℃）M2型巨噬細胞的OD值低于37 ℃時的OD值，差異均有統計學意義（P＜0.001）。72 h時42 ℃熱療對巨噬細胞增殖活性的抑制效果高于37 ℃、41 ℃、43 ℃時，差異均有統計學意義（P＜0.001，見圖5）。

圖5 不同溫度的熱療對巨噬細胞增殖活性的影響Figure 5 The effect of hyperthermia at different temperatures on macrophage proliferation

2.5 RT-PCR檢測M0、M2型巨噬細胞及熱療（42 ℃）后M2型巨噬細胞Ym-1、Arg-1、Fizz-1 mRNA的相對表達水平 M2型巨噬細胞的Ym-1、Arg-1、Fizz-1 mRNA相對表達水平高于M0型巨噬細胞，差異有統計學意義（P＜0.001）。熱療（42 ℃）后M2型巨噬細胞的Ym-1、Arg-1 mRNA相對表達水平低于熱療前，差異有統計學意義（P＜0.001，見圖6）。

圖6 M0型巨噬細胞、M2型巨噬細胞及熱療后M2型巨噬細胞相關因子的相對表達量Figure 6 Relative expression of M0 macrophages，M2 macrophages and M2 macrophages after hyperthermia related factors

2.6 Western blotting法檢測M2型巨噬細胞、熱療（42 ℃）后M2型巨噬細胞Ym-1、Arg-1、Fizz-1蛋白相對表達水平 熱療（42 ℃）后M2型巨噬細胞Ym-1、Arg-1蛋白相對表達水平降低，差異有統計學意義（P=0.014，P=0.029，見圖7）。

圖7 M2巨噬細胞及熱療后M2巨噬細胞相關蛋白情況Figure 7 M2 macrophages and M2 macrophages after hyperthermia related proteins

2.7 Transwell法檢測LLC、LLC+M2、LLC+M2+熱療（42 ℃）中LLC的侵襲、遷移能力

2.7.1 M2型巨噬細胞對LLC侵襲能力的影響 LLC和LLC+M2中LLC侵襲細胞數分別為：（38±4）個和（85±6）個。LLC+M2中LLC侵襲細胞數較LLC增多，差異有統計學意義（P＜0.001，見圖8）。

圖8 M2型巨噬細胞對LLC侵襲能力的影響Figure 8 The effect of M2 macrophages on invasion ability of LCCs

2.7.2 熱療對LLC侵襲能力的影響 LLC+M2和LLC+M2+熱療中LLC侵襲細胞數分別為：（85±6）個和（24±4）個。LLC+M2+熱療中LLC侵襲細胞數較LLC+M2減少，差異有統計學意義（P＜0.001，見圖9）。

圖9 熱療對LLC侵襲能力的影響Figure 9 The effect of hyperthermia on invasion ability of LCCs

2.7.3 M2巨噬細胞對LLC遷移能力的影響 LLC和LLC+M2中LLC遷移細胞數分別為：（92±5）個和（132±6）個。LLC+M2中LLC遷移細胞數較LLC增多，差異有統計學意義（P＜0.001，見圖10）。

圖10 M2型巨噬細胞對LLC遷移能力的影響Figure 10 The effect of M2 macrophages on migration ability of LCCs

2.7.4 熱療對LLC遷移能力的影響 LLC+M2和LLC+M2+熱療中LLC遷移細胞數分別為：（85±6）個和（24±4）個。LLC+M2+熱療中LLC遷移細胞數較LLC+M2減少，差異有統計學意義（P＜0.001，見圖11）。

圖11 熱療對LLC遷移能力的影響Figure 11 The effect of hyperthermia on migration ability of LCCs

3 討論

腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）在微環境中對腫瘤的具體作用是雙重且呈動態變化的，且作為微環境中重要的侵襲轉移的關鍵驅動因素啟動子，其幾乎參與了腫瘤進展、侵襲轉移所有的級聯步驟。在越來越多的研究中報道［7，9］，熱療能夠通過調節腫瘤血流灌注、淋巴細胞的運輸、炎性因子的表達、淋巴細胞與內皮細胞的相互作用，增強先天和適應性免疫功能從而積極廣泛地影響腫瘤免疫微環境［10］。本實驗表明42 ℃熱療可以抑制因子Ym-1、Arg-1、Fizz-1的mRNA及蛋白的相對表達水平，說明熱療能夠使巨噬細胞的表型發生改變，減少M2型巨噬細胞的轉化。

巨噬細胞在調節生理機能、維持各項功能的動態平衡、炎性反應中是不可或缺的一部分。特異性和可塑性是巨噬細胞的特點，在不同微環境和細胞因子的綜合影響下，巨噬細胞可以極化成不同類型，即經典活化的M1型和替代活化的M2型。M1型具有釋放促炎因子、調節Th1型免疫、抗原的提呈等功能；而M2型則表現出“抑炎”功能，可以促進血管生成和組織修復。IL-4、IL-13等均可刺激巨噬細胞實現M2型極化，STAT6信號通路在被IL-4/IL-13激活后可以增加M2型極化所必需的相關基因表達，如Ym-1、Fizz-1、Agr-1［11］。STAT6 是 IL-4/IL-13 介導的 M2 型巨噬細胞極化的關鍵轉錄因子。IL-4和IL-4Rα結合激活 Janus 激酶1（Janus kinase 1，JAK1）/JAK3或JAK1/酪氨酸激酶2（tyrosine kinase 2，Tyk2），促進胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS）的聚集，進而使 STAT6 酪氨酸磷酸化并形成二聚體，進入細胞核啟動M2型巨噬細胞相關基因表達，調節包括 Arg-1、CD206、Fizz-1及Ym-1在內的相關因子的表達［12］。本研究采用侵襲和遷移實驗，首先觀察M2型TAMs對LLC共培養后的侵襲、遷移能力的變化。通過Transwell共培養的結果觀察到，M2型巨噬細胞對促進LLC細胞的侵襲與遷移作用明顯，與既往研究報道相符［13］。在此基礎上，行42 ℃水浴加熱干預，結果提示熱療能夠抑制LLC的侵襲和遷移。在ZHANG等［14］的研究中發現缺氧微環境能夠通過ERK信號的激活使巨噬細胞從M1型向M2型偏轉，從而促進LLC在體內和體外的侵襲轉移。由于缺氧能夠介導侵襲性腫瘤行為，促使M1型向M2型TAMs表型的極化，而熱療能夠改善腫瘤組織乏氧環境已被許多研究所明確，所以推測熱療可能是通過對乏氧的改善從而抑制LLC的侵襲與遷移，但具體機制是怎樣的？仍需要更多的研究進一步闡明。

綜上所述，熱療在TME中有著重要的免疫調節功能，探討熱療調控腫瘤相關巨噬細胞極化的相關機制，不僅有利于對腫瘤發生發展過程的認識，還可以通過合理干預巨噬細胞極化過程中的某些關鍵步驟，扭轉M1/M2型巨噬細胞間偏移的極化失衡狀態，可為治療多種腫瘤提供新的角度和思路。

作者貢獻：饒紫琦進行文章的構思與設計，數據收集，統計學處理，結果的分析與解釋，撰寫論文；劉菁進行研究的實施與可行性分析；陳炳林進行數據整理；鄧永然進行論文的修訂；劉文其負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。