SHP2在難治性肝細(xì)胞癌中的水平變化及作用

劉金菊，李欽勇

臨沂市腫瘤醫(yī)院內(nèi)三科，山東臨沂 276001

肝細(xì)胞癌可由慢性肝病和肝硬化發(fā)展而來(lái)[1-2]。盡管這種疾病可通過(guò)手術(shù)切除進(jìn)行治療，但由于腫瘤范圍或潛在的肝功能不全，大多數(shù)患者不符合手術(shù)條件[3-4]。現(xiàn)階段還可通過(guò)肝移植、經(jīng)皮乙醇或乙酸消融、經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞等方法治療，治療方案的選擇取決于疾病病程和潛在肝臟疾病的嚴(yán)重程度[4]。但由于手術(shù)切除后頻繁復(fù)發(fā)及患者對(duì)常規(guī)化療的反應(yīng)較差，肝細(xì)胞癌長(zhǎng)期生存情況并不理想。調(diào)查顯示，每年肝細(xì)胞癌的病死與全球發(fā)病人數(shù)相似，這也突顯了這種侵略性疾病的高病死率[5]。越來(lái)越多的證據(jù)顯示，肝細(xì)胞癌的化學(xué)抗性、頻繁復(fù)發(fā)均與肝細(xì)胞癌干細(xì)胞存在關(guān)聯(lián)，因此，探討肝細(xì)胞癌干細(xì)胞關(guān)聯(lián)的分子機(jī)制可制訂出更有效的治療策略[6-8]。由PTPN11編碼的含Src-homology 2結(jié)構(gòu)域的磷酸酶SHP2是完全激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶所必需的，在細(xì)胞存活和生長(zhǎng)中起正調(diào)節(jié)作用[9-10]。NEEL等[11]研究顯示，有條件的SHP2消融可顯著減弱部分肝切除術(shù)后細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶激活和肝臟再生。還有研究表明，肝細(xì)胞特異性SHP2消融增加膽汁酸分泌，這一過(guò)程促進(jìn)相關(guān)蛋白的合成和肝細(xì)胞癌的發(fā)展[12]。本文主要研究難治性肝細(xì)胞癌中SHP2的水平變化及其對(duì)肝細(xì)胞癌干細(xì)胞擴(kuò)增的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株SMMC-7721裸鼠模型建立 人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株SMMC-7721購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心。BALB/c-nu裸鼠，雌性，4～6周齡，體質(zhì)量(16±3)g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證：SCXK(滬)2012-0002，SPF級(jí)飼養(yǎng)。在37 ℃、5% CO2條件下，DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞胰酶消化、離心和計(jì)數(shù)后，用生理鹽水制成細(xì)胞懸液。按2×105的劑量將細(xì)胞懸液接種于裸鼠背部皮下，約2周后分離腫塊，將其切為0.1 cm3的立方體，接種于裸鼠右腋下，共16只。隨機(jī)將裸鼠分為順鉑組和對(duì)照組，每組8只。放歸飼養(yǎng)后，順鉑組裸鼠每隔1 d瘤內(nèi)注射2 mg/kg順鉑，對(duì)照組以等體積磷酸鹽緩沖鹽水替代。期間觀察第0、3、6、9天的腫瘤體積，測(cè)量長(zhǎng)度和寬度。腫瘤體積(cm3)=1/2×長(zhǎng)度×寬度2。喂養(yǎng)7周后處死裸鼠，完全切除富含順鉑耐藥細(xì)胞的殘留癌組織(順鉑組)和完整癌組織(對(duì)照組)。

1.1.2患者組織裸鼠模型建立 隨機(jī)取本院就診的2例難治性肝細(xì)胞癌患者腫瘤組織標(biāo)本。將癌組織切成0.1 cm3的體積，并分別皮下接種裸鼠，1例患者的標(biāo)本接種8只，分開(kāi)飼養(yǎng)，其中4只裸鼠使用索拉非尼(購(gòu)自德國(guó)Bayer公司)進(jìn)行治療，劑量30 mg/kg，列為索拉非尼1組(n=4)；另1例患者標(biāo)本接種裸鼠后同樣處理，列為索拉非尼2組(n=4)。其余8只使用等體積磷酸鹽緩沖鹽水替代索拉非尼，列為空白組1組(n=4)和空白2組(n=4)。難治性肝細(xì)胞癌納入標(biāo)準(zhǔn)：初確診時(shí)診斷為肝細(xì)胞癌，經(jīng)穿刺活檢病理確認(rèn)；為復(fù)發(fā)疾病，或存在轉(zhuǎn)移病灶；手術(shù)取樣或有活檢留樣。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)且符合倫理學(xué)要求。

1.2方法

1.2.1引物序列和Western blot檢測(cè) 計(jì)算腫瘤體積后，將一部分組織標(biāo)本置于液氮中，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)。使用ABI PRISM 7300序列檢測(cè)器(Applied Biosystems)通過(guò)PCR確定特定轉(zhuǎn)錄本的原始量。使用IRDye 800CW偶聯(lián)抗體和LI-COR成像系統(tǒng)通過(guò)Western blot分析肝細(xì)胞癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)提取物。SHP2(人)PCR上游引物序列：5′-CTG CCT CCA CAC CAG TGA TA-3′，下游引物序列：5′-GGA GCC TGA GCA AGG AGC-3′。 SHP2序列置亂：5′-GGA CTC AA-TTT GTG AGA AT-3′。SHP2抗體(兔多克隆抗體)購(gòu)自Abcam公司(中國(guó)，ab17940)。

1.2.2肝細(xì)胞癌干細(xì)胞中SHP2相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè) 人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株于37 ℃、5 % CO2條件下培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞80%密度時(shí)除去培養(yǎng)基，胰蛋白酶消化。消化完成后加入新鮮培養(yǎng)基，按1∶4進(jìn)行傳代培養(yǎng)。待80%貼壁細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁完全消化下來(lái)后，離心收集細(xì)胞，緩沖液洗滌后加入無(wú)血清含雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)。待懸浮細(xì)胞長(zhǎng)至70～80 nm穩(wěn)定傳代肝細(xì)胞癌干細(xì)胞。選擇肝細(xì)胞癌細(xì)胞株SMMC-7721、LM3、HepG2和Huh7按照上述方法培養(yǎng)，PCR檢測(cè)SHP2的相對(duì)表達(dá)水平，以培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞作為對(duì)照。上述細(xì)胞株均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心。相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCt計(jì)算。

1.2.3SHP2對(duì)肝細(xì)胞癌干細(xì)胞擴(kuò)增的影響 表達(dá)SHP2的腺病毒購(gòu)自Vigene Bioscience公司(中國(guó))。SMMC-7721 shSHP2穩(wěn)定細(xì)胞株使用表達(dá)shSHP2的慢病毒構(gòu)建，RNA序列置亂作為對(duì)照組。在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)肝細(xì)胞7 d，在顯微鏡下計(jì)數(shù)。將原代肝細(xì)胞癌的單細(xì)胞懸液接種在6孔超低附著培養(yǎng)板中，并感染Lenti-shSHP2和對(duì)照。使用體外有限稀釋法比較SMMC-7721、LM3細(xì)胞株Lenti-shSHP2和對(duì)照組中肝細(xì)胞癌干細(xì)胞頻率。使用泊松分布統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)和L-Calc軟件程序(版本1.1)分析肝細(xì)胞癌干細(xì)胞的比例。將被慢病毒感染的細(xì)胞接種于NOD/SCID鼠(購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，3～8周齡，許可證同BALB/c-nu裸鼠)皮下，注射細(xì)胞量為1 000～100 000，7周后評(píng)估腫瘤發(fā)生情況，處死并取出腫瘤，比較腫瘤大小。

2 結(jié) 果

2.1對(duì)照組和順鉑組裸鼠腫瘤體積、SHP2水平比較 隨著飼養(yǎng)時(shí)間增加，對(duì)照組裸鼠腫瘤體積明顯增加(F=30.964，P<0.001)，且明顯高于同時(shí)間段順鉑組；而順鉑組腫瘤體積隨著時(shí)間增加無(wú)明顯變化(F=1.194，P=0.330)。比較2組裸鼠SHP2蛋白水平和mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果顯示，順鉑組SHP2蛋白水平和mRNA的相對(duì)表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)表1、2。

表1 不同飼養(yǎng)時(shí)間對(duì)照組和順鉑組腫瘤體積比較

2.2空白組和索拉非尼組裸鼠SHP2水平比較 空白1組和空白2組SHP2蛋白水平和mRNA的相對(duì)表達(dá)水平均明顯低于索拉非尼1組和索拉非尼2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)表3。

表2 對(duì)照組和順鉑組SHP2蛋白水平和mRNA的相對(duì)表達(dá)水平比較

表3 對(duì)照組和索拉非尼組裸鼠SHP2蛋白水平和mRNA的相對(duì)表達(dá)水平比較

組別蛋白mRNA空白2組1.01±0.300.98±0.01索拉非尼2組2.16±0.432.54±0.40t6.2047.798P<0.001<0.001

2.3不同細(xì)胞株貼壁細(xì)胞和肝細(xì)胞癌干細(xì)胞中SHP2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平比較 在肝細(xì)胞癌細(xì)胞株SMMC-7721、LM3、HepG2和Huh7中，相較于貼壁細(xì)胞，肝細(xì)胞癌干細(xì)胞中SHP2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)表4。

表4 不同細(xì)胞株貼壁細(xì)胞和肝細(xì)胞癌干細(xì)胞中SHP2mRNA的相對(duì)表達(dá)水平比較

2.4SHP2對(duì)肝細(xì)胞癌干細(xì)胞擴(kuò)增的影響 與RNA序列置亂的對(duì)照比較，shSHP2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞癌細(xì)胞中球狀體的比例降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表5。接種于NOD/SCID鼠后，相較于SMMC-7721對(duì)照組，SMMC-7721 shSHP2組致腫瘤數(shù)更少，但2組數(shù)據(jù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表6。

表5 SMMC-7721和LM3細(xì)胞株球狀體比例比較(%)

表6 不同細(xì)胞注射量SMMC-7721對(duì)照組和SMMC-7721shSHP2組在NOD/SCID鼠中的致腫瘤數(shù)(n/n)

3 討 論

許多肝細(xì)胞癌患者就診時(shí)即被診斷為晚期，錯(cuò)過(guò)了進(jìn)行手術(shù)治療的機(jī)會(huì)[13]。由于肝細(xì)胞癌的化學(xué)耐藥性，包括肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)在內(nèi)的常規(guī)化療很大程度上對(duì)患者無(wú)效[14]。對(duì)于那些接受手術(shù)切除的患者，頻繁的復(fù)發(fā)會(huì)導(dǎo)致生存期較差。因此，針對(duì)此類患者癌組織特異性指標(biāo)變化的研究尤為重要，可用于臨床早期疾病診斷。

本研究結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的增加，給予治療的順鉑組裸鼠的腫瘤體積未明顯增加，而未給予順鉑的對(duì)照組腫瘤體積變化明顯。處死裸鼠后，比較2組SHP2蛋白水平和mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果顯示，SHP2的表達(dá)在順鉑耐藥的肝細(xì)胞癌癌組織中顯著增加，這說(shuō)明SHP2的表達(dá)與化學(xué)耐藥性相關(guān)。為了驗(yàn)證這一結(jié)果，筆者取2例難治性肝細(xì)胞癌患者(索拉非尼耐藥)病理組織標(biāo)本建立移植瘤模型。比較2組裸鼠SHP2的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，相較于對(duì)照組裸鼠，難治性肝細(xì)胞癌移植癌組織SHP2蛋白水平和mRNA的相對(duì)表達(dá)水平更高。因此，筆者推測(cè)SHP2表達(dá)與化學(xué)抗性或肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)相關(guān)。

肝細(xì)胞癌干細(xì)胞的存在被認(rèn)為是腫瘤化學(xué)抗藥性和肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的起源[15]。因此，破譯肝細(xì)胞癌干細(xì)胞調(diào)控的分子機(jī)制，是開(kāi)發(fā)針對(duì)肝細(xì)胞癌干細(xì)胞新型治療策略的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。考慮SHP2在難治性肝細(xì)胞癌中的異常表達(dá)和肝細(xì)胞癌干細(xì)胞在難治性腫瘤中的重要性，本研究用貼壁細(xì)胞作對(duì)照，比較其與肝細(xì)胞癌干細(xì)胞中SHP2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示，肝細(xì)胞癌細(xì)胞株SMMC-7721、LM3、HepG2和Huh7的肝細(xì)胞癌干細(xì)胞中SHP2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平明顯增加。為了驗(yàn)證這一結(jié)果，筆者構(gòu)建shSHP2表達(dá)穩(wěn)定肝細(xì)胞癌細(xì)胞株(SMMC-7721和LM3)，以RNA序列置亂為對(duì)照，比較肝細(xì)胞癌干細(xì)胞比例。結(jié)果顯示，shSHP2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞癌細(xì)胞中球狀體的計(jì)數(shù)比例降低。接種于NOD/SCID鼠后，相較于SMMC-7721對(duì)照組，SMMC-7721 shSHP2組致腫瘤數(shù)更少。因此，shSHP2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞癌細(xì)胞中干細(xì)胞的比例降低，說(shuō)明SHP2耗竭降低了肝細(xì)胞癌干細(xì)胞的比例。盡管如此，SHP2在肝細(xì)胞癌干細(xì)胞中的作用仍不清楚，需要進(jìn)一步研究討論。