廣西黑衣壯兒童VDR基因rs1544410、rs7975232位點多態性研究

陸壯念，林娜，梁立婷，楊麗娟

(1. 右江民族醫學院附屬醫院兒科，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫學院研究生學院，廣西 百色 533000)

維生素D受體(Vitamin D receptors，VDR)基因定位于人染色體12q13上，能夠編碼親核蛋白，從而介導1，25(OH)2D3在人體生理學過程中發揮生物效應[1]。研究發現[2]，VDR基因突變與遺傳學疾病的發生有關。VDR基因中單個堿基突變雖然不明確引起遺傳病，但在人群中有一定分布頻率成為單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism，SNP)[3]。這種SNP多態性可穩定遺傳，從而引起子代多種疾病發生發展。目前國內外研究報道共有22個點突變能夠導致VDR基因功能的缺失[4-5]。rs1544410、rs7975232位點的基因型和等位基因頻率在不同地區、不同種族之間差異報道結論不一，而在廣西黑衣壯兒童中分布研究尚未見報道。本次研究通過選取115例廣西黑衣壯兒童為研究對象，分析其VDR基因rs1544410、rs7975232位點基因型和等位基因分布及特點，比較與其他地區不同種族人群差異情況，為后續研究VDR在不同地區種族人群中與各種疾病相關性和致病因素研究提供科學理論依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年5月—2019年5月在我院兒童保健康復科體檢健康兒童為研究對象。納入標準：①年齡<14歲；②臨床指標、發育指標正常；③兒童祖輩三代均為廣西黑衣壯；④兒童本人和(或)監護人知情同意并自愿參與研究。最后納入115名，男童66名，女童49名，年齡3～12歲。本次研究經過我院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采取所有研究對象外周靜脈血2 ml，置于EDTA抗凝管中，3500 r/min，15 min離心取上層血清。采用離心柱型血液基因組DNA 提取試劑盒提取DNA，操作步驟詳見說明書，置入-80℃保存待測。

1.2.2 引物設計 通過primer3在線軟件(http：//primer3.ut.ee/)設計引物，委托捷瑞生物工程(上海)股份有限公司合成。擴增rs1544410 位點和rs7975232位點的引物見表1。

表1 rs1544410位點和rs7975232位點引物序列

1.2.3 PCR擴增反應 采用15 μl反應體系，其中包括2.0 μl模板 DNA，10×Buffer1.5 μl 、Mg2+1.5 μl 、1 UTaq 酶、0.3 μl dNTP、1 μl多重PCR引物，剩余的體積用雙蒸水補足至15 μl ，充分混勻，離心，置入八連管中。PCR反應采用東勝龍黑金剛 EDC-810 PCR 儀，反應條件：95℃預變性 2 min；擴增程序：95℃ ×3 min，94℃×15 s，55℃×15 s，72℃ ×30 s，共35個循環，最后72℃延伸 3 min。

1.2.4 PCR產物純化 PCR擴增后取3 μl產物用0.2 μl ExoI(Fermentas公司)和0.8 μl Fer-mentas公司生產的FastAP純化。

1.2.5 延伸反應 延伸反應體系：PCR 產物2 μl ，SNaPshot Multiplex kit 1 μl ，延伸引物1 μl ，水補至6 μl 。延伸反應程序：96℃ ×1 min；96℃ ×10 s，52℃×5 s，共30個循環60℃×30 s。

1.2.6 SNP分析 取1 μl加入10 μl buffer，95℃變性 3 min，立即冰水浴，上測序儀(ABI3730xl)。SNP分型用 GeneMapper 4.1軟件分析。

1.3 其他民族、地區基因多態性數據獲取 通過在線Ensembl基因組數據庫(http://asia.ensembl.org/index.html)獲取千人基因組計劃VDR基因位點rs1544410、rs7975232在其他民族、地區基因多態性分布數據。

1.4 統計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行數據的統計分析，用計數法直接計算基因型和等位基因頻率，采用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗群體代表性，基因型頻率和等位基因頻率采用χ2檢驗或Fisher確切概率法作比較，檢驗水準：α =0.05。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SNP位點Hardy-Weinberg平衡和基因型分布 VDR基因位點rs1544410、rs7975232基因分型經Hardy-Weinberg平衡檢驗分析，兩位點基因型均符合Hardy-Weinberg平衡，所選人群均具有群體代表性(P>0.05)，結果具有代表性。rs1544410位點存在CC 、CT兩種基因型，基因型峰型見圖1。rs7975232位點存在CC 、AA 、AC三種基因型，基因型峰型見圖2。

注：A為CC基因型峰型；B為CT基因型峰型。

注：A為AA基因型峰型；B為AC基因型峰型；C為CC基因型峰型。

2.2 VDR基因rs1544410、rs7975232 SNP分布 廣西黑衣壯兒童人群VDR 基因rs1544410基因型CC和CT、等位基因C和T在男童和女童中分布差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2。rs7975232基因型CC、AC、AA和等位基因A、C在男童和女童中分布差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表2 VDR基因rs1544410位點多態性在廣西黑衣壯兒童中的比較

表3 VDR基因rs7975232位點多態性在廣西黑衣壯兒童中的比較

2.3 VDR基因rs1544410、rs7975232不同地區、民族間比較 經過比較分析，廣西黑衣壯兒童rs1544410基因型分布、等位基因頻率與1000 Genomes Project的JPT、YRI、GIH、IBS差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。廣西黑衣壯兒童rs7975232與1000 Genomes Project的YRI、GIH、IBS差異有統計學意義(P<0.05)，見表5。

3 討論

VDR是類固醇急速受體和甲狀腺激素受體超家族和能源之一，本質上是一種配體依賴性轉錄因子[6]。維生素D的絕大多數生物學功能是通過VDR介導從而調節靶基因轉錄過程而實現。隨著分子生物學技術

表4 VDR基因rs1544410位點基因型和等位基因分布頻率與各種族人群中的比較

表5 VDR基因rs7975232位點基因型和等位基因分布頻率與各種族人群中的比較

和基因組學的發展，學者發現VDR上存在多個SNP位點，這些位點與疾病的發生、發展有關。而遺傳可能與環境因素相互作用，從而導致疾病在不同人群中發生率有差異。VDR基因位于人類常染色體12q13上，由8個編碼外顯子和6個非編碼外顯子交替剪接而成，約75個堿基[5]。VDR廣泛分布于人體內組織細胞中，除了分布在腸道、腎臟和骨骼等靶器官外，在血液系統、泌尿生殖系統、神經系統和多種免疫細胞膜中也有分布[7]。

目前研究發現，VDR的SNP與慢性腎臟病[8]、糖尿病[9]、支氣管哮喘[10]、自身免疫性疾病[11]、結核病[12]、腫瘤[13]和高血壓[14]等多種疾病有關。Zhao DD 等[15]通過薈萃分析發現，亞洲兒童哮喘中ApaI基因(rs7975232)SNP起到特殊作用，但BsmI(rs1544410)基因SNP對兒童哮喘易感性的影響卻很小。Li J等[16]研究發現，VDR基因的7579232位點可能與中國漢族人群的系統性硬化癥患者的發病有關，且ApaI基因型頻率的優勢模型可能與紅細胞沉降率風險增加有關。Al-Ghafari AB等[17]在沙特人中研究發現，VDR SNPs rs7975232的SNP增加直腸癌的發生風險，而rs1544410 SNP降低了直腸癌的發生風險，提示ApaI和TaqI SNP可能被用作沙特人直腸癌的診斷生物標志物。Pepineli AC等[18]研究發現，VDR的SNP與麻風病的發生有關，但rs1544410、rs975232位點SNP形成的單倍型與麻風病本身和多細菌臨床形式有關。以上研究均證明，同一基因位點在不同地區人群中可能導致不同疾病的發生風險不同。因此為了了解不同地區、不同民族或種族VDR基因多態性的分布和表達差異，為SNP在疾病的基因診斷、個體化治療實施中應用提供科學理論依據。

壯族是我國人數最多的少數民族，集中分布在廣西壯族自治區。黑衣壯是壯族中一個重要的支系，聚居于西南邊陲廣西那坡縣境內[19]。本次研究中發現，廣西黑衣壯兒童中VDR基因rs1544410中CC、CT基因型占比分別為87.83%、12.17%，等位基因C為93.91%。rs7975232中基因型CC、AC基因型占比為48.70%、43.48%，等位基因C為70.43%。兩個SNP位點基因型和等位基因頻率在不同性別兒童中分布差異無統計學意義，提示性別對VDR基因SNP分別影響不明顯，在分析VDR兩個SNP位點與其他疾病相關性時可以不考慮性別對基因分布的影響。此外，我們還與千人基因組計劃(1000 Genomes Project)研究的結果進行比較。千人基因組計劃是由中美英等多國科研機構聯合發起的，包括歐洲、美洲、亞洲、非洲的14個國家和地區不同人群中2500人的基因數據，是科學界首次千人規模以上基因組的比較，通過發現一些罕見的基因變異，分析與疾病的相關性，為指導預防、治療相關疾病提供參考。本次研究中與千人基因計劃中JPT、YRI、GIH、IBS中VDR基因rs1544410和rs7975232基因型和等位基因頻率，結果發現，廣西黑衣壯兒童rs1544410、rs79752325與其他地區人群相比，基因分布和等位基因頻率差異有統計學意義 ，提示在分析VDR兩個SNP位點與其他疾病相關性時要考慮地區和民族或種族的差異。而這些差異的形成可能是基因和不同地區環境聯合作用導致[20]，可能與生活環境、氣候變化、飲食等因素有關[21]。

本次研究對廣西黑衣壯兒童VDR基因在分析VDR兩個SNP位點與其他疾病相關性時位點基因型和等位基因頻率分布及特點進行首次報道，為VDR基因的SNP與廣西兒童疾病相關性研究提供信息，同時也有助于研究地區性疾病的致病因素以及發生發展的深入研究。但本次研究也存在一定的不足之處。首先，研究的樣本量小，樣本來源單一，可能存在選擇偏倚；第二，三代以內黑衣壯信息由研究對象提供，其真實性無法判斷，可能影響結果的可靠性；第三，研究結果具有區域代表性，在外推應用上可行性局限。這些都有待我們后續擴大樣本量、進一步深入研究解決。

綜上所述，廣西黑衣壯兒童VDR基因rs1544410，rs7975232位點SNP具有地域性，可為當地VDR基因相關疾病的預防和診療研究提供科學理論依據。