酸性核質DNA結合蛋白1的研究進展

崔亞婷，勾文峰，魏會強，于 江，侯文彬*，李祎亮*

(1.天津中醫藥大學，天津 301617； 2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 放射醫學研究所天津市放射醫學與分子核醫學重點實驗室，天津 300192)

酸性核質DNA結合蛋白1(acidic nucleoplasmic DNA-binding protein 1, And-1)主要在細胞核中表達，具備WD40重復序列(WD-repeat,WD40，WDR)和高遷移率組蛋白框結構域(high mobility group-box motif,HMG-box motif)家族的雙重特性[1]，其結構復雜，功能多樣。BLAST數據庫顯示，果蠅、秀麗隱桿線蟲、擬南芥、神經孢子囊、非洲爪蟾中均檢測到了與人類And-1高度相似的蛋白質， 表明該蛋白家族高度保守。And-1家族基因包括來自裂殖酵母的mcl1、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的Ctf4、曲霉(Aspergillusnidulans)的SepB以及人類的And-1。該家族基因包含SepB結構域，SepB盒是該蛋白家族獨有的共性特點，也是區分WD40蛋白或其他傳導蛋白重要的特征。主要影響DNA復制、修復以及姐妹染色體凝聚等[2]。And-1的結構與Ctf4和 Mcl1略有不同，除N端WD40和SepB結構域外，其在C末端還有一個HMG結構域。WD40能介導蛋白與蛋白的相互作用[3]，而HMG蛋白則具有DNA結合的特性[4]。因此，它的功能比Ctf4/Mcl1更復雜、多樣。

1 And-1的結構特征

And-1由氨基末端WD40重復序列、中間SepB結構域和羧基末端HMG框結構域共同組成(圖1A)，該蛋白又名WD重復序列與HMG-box DNA結合蛋白1(WD-repeat/-domain and HMG-box/-domain DNA binding protein 1, WDHD1)。其包含1 127個氨基酸，總分子質量為125 ku，pI為5.27[5]。WD40結構域包含7個葉片結構，形成1個環狀的α-螺旋槳(圖1B)。SepB結構域包含一個WD40子結構域和一個螺旋子結構域，其中WD40子結構域包含6個串聯刀片狀結構，形成了具有間隙的環形結構(圖1C)；螺旋子結構域由5個α螺旋(α1-α5)組成，以螺旋束的形式位于WD40子域的底部[6]。而And-1羧基末端的HMG框結構域晶體結構目前還未被報道。

A.And-1結構域成分概述; B.WD40結構域(左，PDB ID：5GVA)； C.SepB結構域(右，PDB ID：5GVB); aa.氨基酸圖1 And-1蛋白結構示意圖Fig 1 Structure diagram of And-1

2 And-1的結構功能

WD40結構域是真核基因組中最豐富、相互作用最強的結構域之一，其介導蛋白質與蛋白質或蛋白質與DNA的相互作用，并協調下游泛素化、組蛋白甲基化等作用。WD40結構域通常由7個β螺旋結構共同組成圓形結構域，該結構域中心具有一定的大小空腔，可以與藥物小分子以較高的親和力進行結合，介導參與關鍵伴侶蛋白的相互作用。此外WD40結構域的側面和底部也可作為小分子藥物結合位點，從而參與一系列生理過程[7]。以WD40結構域的蛋白作為藥物靶點開發新藥目前已有報道，如WDR5、EED蛋白。

SepB結構域參與介導And-1三聚體的形成。該結構域的螺旋束部分是聚合酶α相互作用的結合位點。釀酒酵母Ctf4的結構中，螺旋H2和 H4之間的半閉合槽可為酵母Pol催化亞基(Pol1)提供結合位點，二者之間的相互作用是由Pol1的CIP基序介導[8]。And-1與Polα的結合與Ctf4不同，其主要通過And-1的C端區域與Polα的特異性B亞基相互作用[6]，而與Polα的CIP基序相互作用很弱。

HMG蛋白屬于DNA結合特征家族。HMG-box/HMGB是由Box A N末端結構域、Box B中央結構域和酸性C末端結構域共同組成特征性結構域[9]。研究顯示，Box A結構域結合DNA，Box B結構域結合并增強DNA彎曲，而C末端尾巴對DNA結合和彎曲特性起調節作用[10-11]。HMG蛋白通過調節DNA結合和彎曲活性來控制DNA復制、轉錄和修復的過程，從而對染色質結構和基因的轉錄產生影響[12]。此外，另有研究表明，And-1與DNA的結合由SepB和HMG之間的中間區域介導。推測這可能是因Polα與AND-1′C末端之間的相互作用，從而影響And-1的HMG結構域與DNA結合。

3 And-1的生化功能(圖2)

圖2 And-1生物功能示意圖Fig 2 Schematic diagram of And-1 biological function

3.1 參與Pre-RC的組裝

真核DNA的復制開始之前包括復制前復合物(pre-replication complex,pre-RC)的組裝、激活和形成復制體等多步驟準備過程。And-1首先參與復制起點處的標記蛋白六亞基起源識別復合物(origin recognition complex,ORC)的組裝。隨后，加載微小染色體維持蛋白(minichromosome maintenance proteins,MCM)復合體的關鍵蛋白Cdc6和Cdt1，在G1期與ORC結合[13]。HBO1是一種H4特異性組蛋白乙酰化酶，對于Cdt1的復制許可至關重要[14]。然而And-1作為MCM2-7負載在染色質上的關鍵元素，可以通過獨立于HBO1的方式促進Cdt1和MCM2-7之間的相互作用。加載MCM之后，And-1將Cdc45和GINS加載到pre-RC上，有助于CMG(Cdc45-MCM-GINS)復合體的形成。

3.2 參與 DNA復制

在高等真核生物中CMG復合物的形成需要SepB和HMG結構域的參與，And-1可與DNA聚合酶α、CMG解旋酶復合物相互作用，橋接CMG解旋酶與DNA聚合酶α，從而協調DNA解鏈和聚合酶活性，調控DNA復制[6]。缺少HMG結構域的Ctf4只能依賴于SepB結構域與復制體進展復合物(replisome promoting complex,RPC)[15]。研究表明，Ctf4和RPC之間的相互作用主要取決于Ctf4與GINS的相互作用，而GINS是RPC中存在的CMG復合物，在DNA復制過程中，Ctf4協調CMG復合物與Polα作用[16]。因此DNA復制需要CMG復合物參與，而細胞中CMG復合物的成熟需要And-1或Ctf4， 其在DNA復制中發揮重要的橋梁紐帶作用[17]。

3.3 參與DNA 修復

DNA雙鏈斷裂(dobule strand break,DSB)是最致命的DNA損傷類型，可能導致有害基因的產生和染色體重排， 從而誘導癌發生。DNA雙鏈損傷修復主要包含非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)和同源重組(homologous recombination,HR)兩種方式[18]。And-1通過調節DNA末端切除來參與同源重組[19]，并且And-1在同源重組過程中擔負著雙重職責，一種是將CtIP招募至DSB部位，另一種是在具有復制壓力的細胞中參與Chk1激活。在HR修復方式中，腫瘤抑制蛋白CtIP對于DSB末端切除必不可少，并以MRN(MER11-RAD50-NBS1)依賴的方式被招募到DSB部位[20]。And-1通過與CtIP以及其他修復蛋白形成復合物，招募CtIP到DSB位點上調節DSB末端切除。此外，將And-1招募到DSB位點還依賴于BRCA1、MDC1和ATM(Ataxia telangectasia mutated)。研究表明，And-1與BRCA1和MDC1存在相互作用，而BRCA1的BRCT(BRCA1 C-terminal domain)結構域對于And-1的再生至關重要，但并不直接結合And-1[19]。

在DSB誘導后，依賴MRN/ATM的DSB末端切除導致形成ssDNA區域，該區域促進ATR激活并通過ATR引起Chk1磷酸化。在沒有And-1或CtIP的情況下，Chk1的磷酸化降低且DSB末端切除受損。And-1在T826處被ATR磷酸化，這是And-1-Claspin相互作用對復制壓力的反應所必需的，但其在T826處的磷酸化對And-1招募或DSB末端切除沒有影響。Claspin是一種與Chk1相互作用的蛋白，可通過蛋白與蛋白之間的相互作用將Chk1帶入停滯的復制叉，以使其被ATR磷酸化。ATR磷酸化And-1是響應復制應激中Chk1激活的關鍵[21]。

3.4 參與姐妹染色單體的內聚

姐妹染色單體的聚集對于減數分裂和有絲分裂中的染色體分離至關重要。研究顯示，減數分裂中姐妹染色體分離之前，And-1耗盡的細胞停滯在前中期和中期，其對姐妹染色體的正確分離至關重要。在G1早期，著絲粒蛋白A(CENP-A)的特異性沉積需要And-1與CENP-A相互作用，And-1介導CENP-A與Holliday連接識別蛋白(Holliday junction recognition protein, HJURP)在著絲粒定位。And-1的下調能導致有絲分裂早期細胞的積累，并造成染色體收縮的缺陷；And-1過表達能增強著絲粒處的CENP-A裝配。因此，And-1與HJURP一起作用，促進CENP-A向著絲粒的細胞周期特異性募集[22]。

4 And-1與癌

And-1在許多腫瘤細胞中呈過表達，尤其是在睪丸癌、惡性淋巴瘤、尿路上皮癌和惡性黑色素瘤，而在腎癌以及大多數肝癌和胰腺癌均為陰性。AKT1激酶磷酸化后能穩定癌細胞中的And-1蛋白，抑制PI3K/AKT通路會降低肺癌中And-1磷酸化的水平，提示其可能是參與癌癥的AKT下游分子。選擇性靶向AKT1和And-1之間的功能性相互作用，極有可能是一種有前景的癌癥治療策略[23]。研究也發現，And-1能通過促進MAPRE2在肺腺癌中的泛素化而導致順鉑耐藥[24]。敲除And-1基因的細胞中添加細胞周期特異性化療藥物，如依托泊苷、PARP抑制劑AZD2281，均可有效提高藥物的敏感性[25]。以上種種證據表明，And-1與潛在耐藥性密切相關,選擇性降解And-1，可以顯著提高許多抗癌藥物在癌中的治療作用。

5 問題與展望

And-1是近年來新發現的DNA結合蛋白，在多種腫瘤細胞中過表達，并且參與DNA復制、轉錄和損傷修復等遺傳相關的生命過程。目前人們對于該靶點的研究仍然處于剛剛起步階段，And-1的功能機制仍需進一步探索和完善，相關小分子抑制劑的開發也需進一步探索和開發。本課題組研究發現了一類化合物直接作用And-1，抑制DNA損傷修復，在抗腫瘤和腫瘤化放療增敏中起作用。本文對And-1的結構特點及功能進行了詳細的綜述，該蛋白WD40結構域的中心空腔口袋可作為小分子藥物的主要靶向結合區，通過選擇抑制蛋白與蛋白相互作用，發揮重要的調控功能。積極深入研究And-1在DNA遺傳和損傷修復的作用機制，有助于廣譜抗癌機制的藥物發現；聯合其他靶點的抗腫瘤藥物，能協同增強抗腫瘤作用，并解決腫瘤藥物耐藥等難題。對該靶點藥物的研發將是一個新穎且極具發展前景的抗腫瘤策略。