miR-183靶向Bnip3l對缺氧/復氧的小鼠海馬神經元細胞線粒體自噬的影響

馬家玲，高艷平

(張家港市第一人民醫院 蘇州大學附屬張家港醫院 麻醉科， 江蘇 張家港 215600)

大腦海馬對缺血缺氧非常敏感，是大腦缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷的好發部位之一，而大腦海馬神經元受損會引起認知功能障礙，是腦損傷的主要表現之一[1]，故抑制海馬神經元受損，是緩解I/R腦損傷的重要手段之一。目前研究發現，線粒體自噬與腦I/R損傷關系密切，其自噬不足或過度激活均可導致神經元細胞變性和死亡而加重腦損傷[2]。研究證實miR-183可抑制自噬并刺激細胞凋亡[3]，且miR-183也可在大腦皮質中特異性表達，并參與神經細胞分化和調控[4]。但miR-183抑制線粒體抑制自噬對I/R腦損傷過程海馬神經元的影響，報道較少。腺病毒基因Bcl-2同源蛋白[B-cell leukemia/lymphoma 2(Bcl-2)/adenovirus E1B interacting protein 3-like，BNIP3L]是介導腦內線粒體自噬，減輕腦缺血損傷的必須成分[5]。但Bnip3l與miR-183的靶向作用還尚不清楚，本研究建立雙熒光素酶報告試驗對兩者的靶向作用，進行驗證，并復制海馬神經元細胞(HT-22)缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型來模擬I/R損傷模型，探討miR-183靶向調控Bnip3l表達對海馬神經元細胞線粒體自噬的影響及作用機制，以期闡明I/R腦損傷的分子生物學機制，為臨床研究提供可靠資料。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系:小鼠源海馬神經元細胞系HT-22(ATCC：American Type Culture Collection)。

1.1.2 主要試劑:miR-183激動劑(miR-183 mimics，Signosis公司)及陰性對照(miR-183NC)(System Biosciences公司)；四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)(Sigma-Aldrich公司)；Trizol試劑盒(北京麥瑞博公司)；反轉錄RT試劑盒(武漢純度生物科技有限公司)；DMEM 高糖培養基(Hyclone 公司)；BCA 蛋白定量試劑盒、胰蛋白酶(Pierce 公司)；泛素和LC3結合蛋白p62(ubiquitin-and LC3-binding protein p62，p62)抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；BNIP3L抗體(武漢菲恩生物科技有限公司)；自噬相關蛋白beclin-1抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3-Ⅱ)、LC3-I抗體(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 HT-22的分組及處理：收集對數期細胞，以每孔2×105個細胞接種于6孔板上，適應性培養24 h后，將其分為對照組、缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型(HR)組、miR-183過表達組(miR-183 mimics)、陰性對照(miR-183 NC)組。對照組細胞不任何處理，使其自然增值；除對照組外，其余各組細胞均按文獻[6-7]方法于3氣培養箱中缺氧3 h，復氧12 h建立缺氧復氧模型，miR-183 mimics組和miR-183 NC組分別在缺氧3 h后轉染miR-183 mimics和miR-183 NC試劑，轉染后進行復氧12 h培養，轉染方法嚴格按照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書進行。各組細胞按上述方法處理后，收集細胞，以備后續試驗。將新購的HT-22細胞復蘇后，接種于含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的高糖DMEM培養基中，置于條件為 37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養48 h，當細胞匯合度>80%后，進行常規傳代、計數。

1.2.2 MTT法測定HT-22細胞存活率：取對數期細胞，每組設置6個復孔，向每個孔中加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，隨后在37 ℃下再孵育1 h，小心丟棄含有MTT溶液的培養基，并加入200 μL二甲基亞砜(DMSO)以溶解沉淀物。使用自動多孔分光光度計測量490 nm的吸光度(A)值，存活率(%)=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.2.3 透射電鏡觀察線粒體結構：細胞按文獻[7]方法加入5 mL 2.5%戊二醛固定、磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，用l%四氧化鋨在4 ℃下固定30 min、PBS洗滌后，用2%醋酸鈾水溶液染色30 min、乙醇梯度脫水，3 mL純丙酮-EPON812包埋后，于37、45、60 ℃烘箱內烘烤固化后，切成1 μm切片，2%醋酸鈾染色并切成50 nm超薄切片，用醋酸-檸檬酸染色后于JEM-1200EX透射電鏡下觀察線粒體超微結構。

1.2.4 RT-qPCR檢測各組細胞miR-183、Bnip3l mRNA相對表達水平：利用Trizol試劑盒抽提細胞總RNA，應用反轉錄試劑盒將1 μg RNA反轉錄為cDNA，反轉錄體系為10 μL(2 μL 5× reaction mix，1 μL random primer，0.5 μL反轉錄酶，5 μL RNA樣品)，反應條件(置于42 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min滅活反轉錄酶活性)。將cDNA稀釋10倍進行RT-qPCR反應，反應體系為cDNA 4 μL，正向引物、反向引物各0.4 μL，SYBR Green/Flourescein qPCR Maxter Mix 10 μL，去離子水5.2 μL。反應條件為95 ℃預熱3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，上述3步驟35次循環，72 ℃ 5 min終止反應。miR-183以U6為內參基因，Bnip3l mRNA以β-actin為內參基因，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成設計(表1)。用2-ΔΔCt算法計算miR-183、Bnip3l mRNA相對表達量。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 RT-qPCR primer sequences

1.2.5 Western blot檢測BNIP3L、beclin-1、p62、LC3-Ⅱ/ LC3Ⅰ蛋白表達：取各組細胞，加細胞裂解液裂解細胞，離心分離后，取上清液提取蛋白，按BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度，并灌制SDS-PAGE凝膠后，取200 μg蛋白進行SDS-PAGE，接著將全部蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，并置于5%的脫脂奶粉溶液中，于搖床上37 ℃封閉2 h，將目的蛋白條帶，置于孵育盒中，加入抗體(BNIP3L、 beclin-1、p62、LC3-Ⅱ、 LC3-Ⅰ，β-actin(內參)，1∶1 000、1∶500、1∶1 000、1∶1 000，1∶2 000)于4 ℃冰箱中孵育過夜，經TBST漂洗3次，加入1∶1 000的羊抗兔二抗溶液，于搖床上室溫孵育2 h，經TBST再次漂洗3次，采用增強化學發光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以Image-J軟件分析各組蛋白相對表達。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因試驗：合成Bnip3l的3′非翻譯區(3′UTR)的miR-183識別序列，克隆至pmiRGlo載體，得到pmiRGlo-Bnip3l-3′UTR-WT。另外對miR-183識別區Bnip3l堿基進行突變連接至pmiRGlo載體，得到得到pmiRGlo-Bnip3l-3′UTR-MUT，分別將pmiRGlo-Bnip3l-3′UTR-WT、pmiRGlo-Bnip3l-3′UTR-MUT質粒與miR-183 NC、miR-183 mimics共轉染，分為miR-183NC+Bnip3l-3′UTR-WT組、miR-183 mimics+Bnip3l-3′UTR-WT組、miR-183NC+Bnip3l-3′UTR-MUT組、miR-183 mimics+Bnip3l-3′UTR-MUT組，24 h后按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書添加螢火蟲和海參熒光素酶試劑上機檢測。每孔的數值以螢火蟲熒光活性/海參熒光活性顯示，試驗重復3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組HT-22細胞存活率比較

與對照組相比，HR組和miR-183 NC組細胞存活率均下降(P<0.05)，與HR組和miR-183 NC組相比，miR-183 mimics組細胞存活率降低(P<0.05)(表2)。

表2 各組HT-22細胞存活率比較Table 2 Comparison of survival rate of HT-22 cells

2.2 各組HT-22細胞線粒體結構觀察

對照組細胞核仁明顯，線粒體結構清晰，核糖體豐富；HR組和miR-183 NC組核仁消失，膜狀結構自噬體增多，可見線粒體自噬及自噬后殘留的黑色素；miR-183 mimics組細胞核固縮，膜狀結構自噬體較少，線粒體結構紊亂，甚至模糊(圖1)。

圖1 透射電鏡觀察線粒體超微結構Fig 1 Ultrastructure of mitochondria observed by transmission electron microscope (×2 500)

2.3 各組HT-22細胞miR-183、Bnip3l mRNA表達水平

與對照組相比，HR組和miR-183 NC組細胞miR-183表達下降(P<0.05)，Bnip3l mRNA表達升高(P<0.05)；與HR組和miR-183 NC組相比，miR-183 mimics組細胞miR-183 表達升高(P<0.05)，Bnip3l mRNA表達降低(P<0.05)(表3)。

表3 各組HT-22細胞miR-183、Bnip3l mRNA相對表達水平Table 3 Relative expression levels of mir-183 and Bnip3l mRNA in HT-22 cells of each n=6)

2.4 各組HT-22細胞自噬相關蛋白BNIP3L、beclin-1、p62、LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ相對表達水平

與對照組相比，HR組和miR-183 NC組細胞BNIP3L、beclin-1、LC3-Ⅱ/ LC3Ⅰ表達升高(P<0.05)，p62表達下降(P<0.05)；與HR組和miR-183 NC組相比，miR-183 mimics組細胞BNIP3L、beclin-1、LC3-Ⅱ/ LC3Ⅰ表達下降(P<0.05)，p62表達升高(P<0.05)(圖2，表4)。

圖2 Western blot檢測各組HT-22細胞BNIP3L、beclin-1、p62、LC3-Ⅱ/ LC3Ⅰ蛋白表達Fig 2 Western blot of BNIP3L, beclin-1, p62,LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ protein expression in HT-22 cells of each group

表4 各組細胞BNIP3L、beclin-1、p62、LC3-Ⅱ/ LC3Ⅰ蛋白表達水平Table 4 Protein expression levels of BNIP3L, beclin-1, p62, LC3-Ⅱ/ LC3Ⅰ in each n=6)

2.5 雙熒光素酶法檢測miR-183與Bnip3l關系

miRtarbase預測顯示，miR-183與Bnip3lmRNA 3′UTR區域有結合位點。雙熒光素酶報告基因檢測顯示，與miR-183+Bnip3l-3′UTR-WT組比較，miR-183 mimics+Bnip3l-3′UTR-WT組熒光素酶活性降低(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with miR-183NC+Bnip3l-3′UTR-WT圖3 miRtarbase預測miR-183與Bnip3l的靶向關系及雙熒光素酶報告基因分析結果Fig 3 Prediction of targeting relationship between miR-183 and Bnip3l by miRtarbase and analysis of dual-luciferase reporter gene

3 討論

I/R損傷引起的腦損傷，是導致成年人致死和致殘的主要原因之一，其病理和生理過程復雜，涉及神經元細胞的凋亡、自噬、炎性反應、修復等過程。體外培養經過永生化處理的海馬神經元HT-22細胞并建立缺氧/復氧(H/R)模型，可直接觀察細胞形態并監測其生理、生化、代謝等功能的改變，是研究I/R損傷體外細胞水平的最佳手段[8]。

在短暫全腦缺血/再灌注后海馬錐體神經元上可觀察到自噬空泡等自噬現象[9]，研究證實，在腦損傷初期，自噬激活對低氧引起的腦缺血神經細胞有保護作用[10]，氧糖剝奪2 h后，用自噬抑制劑抑制自噬可加重腦損傷，反之用雷帕霉素誘導自噬可減少神經元凋亡緩解腦損傷[11]，另外在氧糖剝奪6 h后用自噬抑制劑處理可緩解腦損傷，而用自噬激活劑處理，神經元及腦損傷反而加重，表明在腦損傷初期抑制自噬可加重神經元和腦損傷，而在腦損傷后期抑制自噬可減緩腦損傷。本研究用氧糖剝奪3 h后復氧6 h處理HT-22神經元細胞，發現HR組HT-22細胞存活率低于對照組，電鏡下觀察可見線粒體自噬及自噬后殘留的黑色素、膜狀結構自噬體等均增多，提示缺氧3 h/復氧12 h神經元細胞中線粒體自噬被激活。miR-183能夠抑制自噬，且在人大腦皮質中有特異性表達，并參與神經細胞分化和調控[12]，本研究在HR組缺氧/復氧HT-22細胞中也檢測到miR-183的表達，且miR-183的表達低于對照組，提示缺氧3 h復氧12 h后，自噬激活，miR-183表達降低，表明miR-183低表達參與神經元細胞自噬激活過程。又有研究證實miR-183過表達可抑制細胞的自噬，促進凋亡[4]。本研究過表達miR-183后，發現miR-183 mimics組miR-183增高后，HT-22存活率低于HR組，電鏡下觀察可見，膜狀結構自噬體減少，線粒體出現結構紊亂、甚至模糊等損傷現象，表明過表達miR-183可抑制缺氧3 h復氧12 h神經細胞線粒體自噬和細胞生存。

BNIP3L位于線粒體外膜，低氧刺激下BNIP3L表達升高，可促進Beclin-1蛋白的游離釋放，并調控下游多種自噬相關Atg蛋白在自噬前體結構中的定位，從而激活線粒體自噬的發生[13]，另外，BNIP3L也可與自噬相關基因Atg8相似同源物LC3和p62結合并介導自噬體靶向清除損傷的線粒體[14]。如發現BNIP3L也是介導缺血腦內線粒體自噬發生所必須的成分，其缺失會導致線粒體自噬障礙，而逆轉其缺失可發揮抗腦缺血損傷，表明Bnip3l也可參與線粒體自噬過程，且與腦I/R再損傷關系密切[15]。本研究發現HR組HT-22細胞Bnip3l mRNA及蛋白、自噬相關蛋白Beclin-1表達和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均高于對照組，p62表達低于對照組，提示缺氧3 h復氧12 h神經細胞，Bnip3l高表達可能與自噬激活有關。而過表達miR-183抑制自噬激活后，miR-183 mimics組Bnip3l mRNA及通路相關蛋白、細胞存活率均明顯低于HR組，提示miR-183高表達后，細胞生存率降低，BNIP3L及缺線粒體自噬均處于抑制狀態，表明過表達miR-183后，可能抑制了BNIP3L介導的線粒體自噬激活，而使缺氧3 h復氧12 h神經細胞損傷加重，miR-183與Bnip3l之間可能存在靶向關系。為了進一步驗證這一推測，本研究采用雙熒光素酶報告試驗進行驗證，發現通過轉染miR-183 mimics與WT-Bnip3l后，雙熒光素酶活性明顯抑制，表明miR-183與Bnip3l存在靶向調控關系。

綜上所述，miR-183過表達可靶向抑制Bnip3lmRNA表達，抑制HT-22細胞線粒體自噬，加重缺氧/復氧所致HT-22細胞損傷。該結果為臨床診斷和治療缺血腦損傷提供一定的參考。但本研究也存在一定的不足，細胞體外實驗與體內實驗具有一定的差異性，線粒體自噬是個復雜的過程，在缺氧/復氧后期miR-183調控BNIP3L介導線粒體自噬與腦損傷的關系還未驗證，這有待后續進一步研究。