白藜蘆醇通過上調annexin A1表達促進氧糖剝奪/復氧大鼠小膠質細胞系向M2型極化

林 敏，張紅梅

(重慶大學附屬三峽醫院 藥學部， 重慶 404000)

小膠質細胞作為中樞神經系統(central nervous system，CNS)的固有免疫細胞，是缺血性卒中發生后神經炎性反應的啟動細胞和最主要的反應細胞。小膠質細胞獨特的經典激活M1型和替代激活M2型兩種極化形式，誘導小膠質細胞由促炎M1型向抗炎M2型極化有利于減輕缺血性腦損傷。白藜蘆醇作為天然的抗炎物質，可調控小膠質細胞向M2型轉化從而減輕急性缺血卒中后神經炎性反應，但具體機制尚不清楚。

研究證實，annexin A(ANXA1)是一種鈣離子依賴的磷脂結合蛋白，富集于中性粒細胞、巨噬細胞和小膠質細胞等免疫細胞，在外周和中樞免疫系統中均發揮著重要的抗炎作用。ANXA1可促進氧糖剝奪的小膠質細胞向M2型轉化，從而減輕神經元損傷[1]。目前，白藜蘆醇對ANXA1的作用尚無報道，本研究通過體外構建氧糖剝奪/復氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)模型，首次探討白藜蘆醇對OGD/R小膠質細胞ANXA1表達的影響，及ANXA1在白藜蘆醇調控OGD/R小膠質細胞向M2型極化的可能作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：兔抗ANXA1抗體(Abcam公司)、兔抗β-actin抗體(CST公司)，HRP-conjugated Affinipure羊抗兔IgG和594-conjugated羊抗兔IgG(H+L)(Proteintech公司)，5%牛血清白蛋白、Prime ScriptTMRT with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa公司)和DME/F12培養基(Gibco公司國)、白藜蘆醇(Sigma-Aldrich公司)，ANXA1相關慢病毒(上海吉凱生物技術公司)。

1.1.2 細胞：大鼠來源的小膠質細胞系N9(上海康朗生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組及處理:將N9細胞隨機分組，未經OGD/R處理組細胞：OGD/R(-)組，構建OGD/R模型細胞：OGD/R(+)組，經Res處理的OGD/R(+)細胞：OGD/R(+)+Res組，經Res及空載慢病毒LV-Scramble處理的OGD/R(+)細胞：OGD/R(+)+Res+LV-Scramble組，經Res及沉默慢病毒LV-Scramble處理的OGD/R(+)細胞：OGD/R(+)+Res+LV-Scramble組。

構建N9細胞OGD/R模型：將正常培養的N9小膠質細胞完全培養基更換為D-Hanks液，并將細胞置于厭氧孵育箱中培養3 h，取出細胞，將D-Hanks液更換為完全培養基，將細胞置于含5% CO2的培養箱中繼續培養24 h(見參考文獻[2])。

慢病毒干預：慢病毒LV-shAnxA1(1×109transduction unit，TU/mL)和LV-Scramble(1×109transduction unit，TU/mL)按MOI=10(TU/細胞)感染慢病毒，培養3天后采用RT-qPCR和Western blot驗證慢病毒感染效率，感染成功方可進行后續實驗。

1.2.2 RT-qPCR檢測ANXA1、TNF-α、IL-1β、IL-10、Arg-1和IL-1β mRNA表達：選取20 μmol/L濃度的白藜蘆醇處理OGD/R模型N9細胞(見參考文獻[3])，24 h后收集各組細胞，根據Trizol試劑盒說明書提取各組細胞的總RNA，然后按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。以1.0 μL cDNA為模板，按10 μL反應體系進行PCR擴增反應,引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primer

1.2.3 Western blot檢測ANXA1和CD11b蛋白含量:白藜蘆醇處理24 h后，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，RIPA裂解液與PMSF蛋白酶抑制劑(100∶1)提取細胞全蛋白，BCA`法測定各樣品的蛋白質濃度。按照30 μg進行上樣，10% SDS-PAGE分離蛋白，加入含細胞裂解液和PMSF(100∶1)的混合液提取各組細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，蛋白上樣量為30 μg。采用10% SDS-PAGE分離蛋白，后采用250 mA恒流對0.45 μm PVDF膜進行電轉，轉膜結束后將PVDF膜先后進行封閉、分別孵育ANXA1和CD11b相應的一抗(4抗過夜)，次日取出PVDF膜，TBST漂洗后孵育相應二抗。采用Fusion凝膠成像系統進行顯影、分析數據。

1.2.4 免疫熒光檢測ANXA1蛋白表達：白藜蘆醇處理24 h后，采用4%多聚甲醛固定細胞30 min，PBS反復漂洗細胞，先后采用0.1% Triton X-100破膜、5% BSA封閉細胞、孵育相應ANXA1一抗(4 ℃過夜)，次日取出細胞爬片，孵育相應二抗，PBS漂洗后孵育DAPI，最后用抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察、攝片。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 白藜蘆醇上調OGD/R模型N9細胞內ANXA1表達

與OGD/R(-)組相比，OGD/R(+)組細胞內ANXA1 mRNA和蛋白含量顯著增多(P<0.01)，OGD/R(+)+Res組ANXA1 mRNA和蛋白較OGD/R(+)組進一步增多(圖1A,B)。OGD/R(+)組ANXA1蛋白核轉位較OGD/R(-)組明顯增多，OGD/R(+)+Res組ANXA1蛋白主要分布在細胞漿(圖1C)。

A.expression of ANXA1 mRNA in each group was detected by RT-qPCR; B.expression of ANXA1 protein in each group was detected by Western blot; C.expression of ANXA1 protein microglia was detected by immunofluorescence; *P<0.01, **P<0.001 compared with OGD/R (-) group; #P<0.01, ##P<0.001 compared with OGD/R (+) group; scale bar=100 μm圖1 白藜蘆醇有效上調OGD/R小膠質細胞內ANXA1 mRNA和蛋白表達Fig 1 Resveratrol effectively up-regulated the expression of ANXA1 mRNA and protein in OGD/R

2.2 慢病毒LV-shAnxA1有效抑制小膠質細胞內ANXA1表達

OGD/R(+)+Res+LV-shAnxA1組細胞內ANXA1 mRNA和蛋白含量較OGD/R(+)+Res+LV-Scramble組和OGD/R(+)+Res組明顯下降(P<0.01)(圖2A,B)。與OGD/R(+)+Res組相比， OGD/R(+)+Res+LV-shAnxA1組ANXA1蛋白含量很低(P<0.01)，ANXA1主要位于細胞核(圖2C)。

A.expression of ANXA1 mRNA in each group was detected by RT-qPCR; B.expression of ANXA1 protein in each group was detected by Western blot; C.expression of ANXA1 protein in microglia was detected by immunofluorescence; *P<0.01 compared with OGD/R(+)+Res group; #P<0.01 compared with OGD/R(+)+Res+LV-Scramble group; scale bar=100 μm圖2 慢病毒LV-shAnxA1有效抑制ANXA1表達Fig 2 Lentivirus LV-shAnxA1 effectively inhibited ANXA1

2.3 沉默ANXA1對白藜蘆醇抑制小膠質細胞活化的影響

OGD/R(+)+Res+LV-shAnxA1組細胞內CD11b蛋白含量較OGD/R(+)+Res組明顯增高(P<0.01)。

與OGD/R(+)+Res組相比，OGD/R(+)+Res+LV-shAnxA1組TNF-α和IL-1β mRNA含量均明顯增高(P<0.001)，Arg-1和IL-10 mRNA含量均顯著降低(P<0.01，P<0.001)(圖3)。

A.expression of CD116 protein in group was detected by Western blot; B.histogram represents quantative analysis of CD116 protein content in each group; C.expression of TNF-α, IL-1β, Arg-cand, IL-10 mRNA in each group was detected by RT-qRCR;*P<0.001, **P<0.01 compared with OGD/R(+)+Res group; #P<0.001, ##P<0.01 compared with OGD/R(+)+Res+LV-Scramble group圖3 白藜蘆醇通過上調ANXA1抑制小膠質細胞激活Fig 3 Resveratrol inhibited microglial activation by up-regulating

3 討論

小膠質細胞介導的神經炎性反應是急性缺血性卒中后諸多復雜病理機制的核心環節。調控小膠質細胞由促炎M1型向抗炎M2型轉換是調控小膠質細胞激活的關鍵策略。明確白藜蘆醇調控小膠質細胞向M2型極化的具體機制是探索白藜蘆醇減輕急性缺血性卒中后神經炎性反應的重要環節[4-5]。ANXA1是膜聯蛋白家族中第一個以鈣依賴的方式與細胞膜結合，受糖皮質激素調節的磷脂結合蛋白，參與細胞凋亡、炎性反應、細胞增殖及分化等[6]。卒中實驗鼠和患者外周ANXA1的水平明顯降低與血栓炎性反應相關，而外源性給予ANXA1可減少血小板活化和血栓形成，該效應與體內整合素合成被抑制有關[7]。

本研究發現OGD/R在誘導的小膠質細胞內ANXA1合成增多，這與報道[8-9]一致。研究證實，富集于CNS小膠質細胞內的ANXA1可通過調控小膠質細胞向M2型極化，從而減輕急性缺血性卒中后神經炎性反應。本研究進一步發現白藜蘆醇可促進OGD/R小膠質細胞內ANXA1表達增多。為證實上述變化是一種伴隨現象抑或具有生理學意義，采用慢病毒LV-shAnxA1沉默AnxA1表達后，白藜蘆醇未能有效上調ANXA1表達，且ANXA1蛋白核轉位明顯減少，推測這與ANXA1表達減少相關。

生理狀態下ANXA1蛋白主要分布于細胞質，OGD/R可誘導ANXA1從胞質轉移至胞核，參與神經元細胞凋亡，這與ANXA1與BH3相互作用域死亡激動劑(BH3-interacting-domain death agonist，Bid)啟動子直接作用，后肌球蛋白IIA以TRPM7激酶依賴性方式協助ANXA1發生細胞核易位從而誘導神經元凋亡[10]。亦有研究發現ANXA1可能通過神經元核轉位信號通路與 importin β相互作用，隨后通過增強p53轉錄活性誘導促凋亡基因bid等介導細胞凋亡[11]。ANXA1在小膠質細胞內的核轉位機制尚不清楚，ANXA1與轉運蛋白-18KDa(translocator protein-18 KDa，TSPO)相互作用介導NF-κB信號通路，從而調控小膠質細胞介導的神經炎性反應[12]。基于小膠質細胞分泌促炎及抗炎介質的特性，本研究選取經典的M1型炎性介質TNF-α、IL-1β和M2型炎性介質Arg-1、IL-10作為小膠質細胞極化的標志。沉默AnxA1后，白藜蘆醇未能降低小膠質細胞標志物M1型標志物表達，而M2型標志物表達明顯減少，因此白藜蘆醇抑制小膠質細胞活化及向M2型極化的作用明顯與白藜蘆醇上調ANXA1相關。但白藜蘆醇抑制ANXA1蛋白核轉位的具體機制及作用暫不清楚，需后續深入研究。

綜上所述，白藜蘆醇可上調ANXA1表達抑制OGD/R模型小膠質細胞向M2型極化，為白藜蘆醇抑制缺血性卒中后的神經炎性反應提供了一定的理論基礎。